نقدم طريقة فعالة من حيث التكلفة لجراتش الهجرة التي توفر نهجا جديدا لتحديد هجرة الخلايا دون استخدام أساليب مكثفة المعدات. في حين تم استخدام الخلايا الليفية في هذا البروتوكول، يمكن تكييفها واستخدامها لدراسة أنواع الخلايا الإضافية والتأثيرات على ترحيل الخلايا.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تعد هجرة الخلايا مكونًا أساسيًا في الأحداث الفسيولوجية والمرضية على حد سواء. مطلوب ترحيل الخلايا العادية لوظائف أساسية مثل تطوير وتركيب استجابة مناعية. عندما يحدث خلل أو تغيير مع عملية هجرة الخلية ، يمكن أن يكون له نتائج ضارة (أي الانبثاث السرطاني ، والتئام الجروح ، وتشكيل الندبة). نظرا لأهمية هجرة الخلايا، فمن الضروري أن يكون الوصول إلى خلية الهجرة فحص بأسعار معقولة، والتكيف، وتكرار. الاستفادة من اختبار الهجرة الصفر المشتركة، وضعنا نهجا جديدا لتحليل الهجرة الخلية التي تستخدم معدات المختبرات العامة. تستخدم الطريقة الموصوفة علامات بصرية تسمح باستعادة مناطق محددة ذات أهمية دون استخدام المجهر الفاصل الزمني. وبالإضافة إلى ذلك، فإنه يوفر المرونة في التصميم التجريبي، بدءا من تغيير الركيزة مصفوفة الهجرة إلى إضافة المعدلات الدوائية. وعلاوة على ذلك، يحدد هذا البروتوكول طريقة لحساب منطقة ترحيل الخلايا، والتي لا يتم اعتبارها من قبل عدة طرق عند فحص ترحيل الخلايا. يقدم هذا النهج الجديد اختبارًا للهجرة الصفرية لجمهور أكبر وسيتيح فرصة أكبر للباحثين لفحص التأثير الفسيولوجي والفيزيولوجي لهجرة الخلايا.
المقدمة
تعد هجرة الخلايا أمرًا حاسمًا للعديد من الأحداث الفسيولوجية وكذلك المرضية. وهو مطلوب أثناء التطوير ، لتركيب استجابة مناعية ، ولتضميد الجروح المناسبة1،2،3. ويمكن أن يتم تشغيل العديد من هذه الأحداث الهجرة الخلية عن طريق الإشارات الفيزيائية أو الكيميائية. على سبيل المثال، أثناء الاستجابة المناعية، سوف تنتقل الكريات البيض نحو موقع الإصابة استجابة لـ2. بالإضافة إلى ذلك، الكريات البيض سوف تطلق أيضا السيتوكينات للحث على الهجرة من الخلايا المناعية إضافية، فضلا عن أنواع الخلايا الأخرى، مثل الخلايا الليفية، التي تشارك في عملية التئام الجروح، وبالتالي، بدء استجاب....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1- ثقافة الخلايا العامة
- الخلايا الليفية القلبية في دولبيككو النسور المعدلة المتوسطة (DMEM) التي تحتوي على 1 غرام / لتر الجلوكوز، بيروفات الصوديوم، L-الجلوتامين، ومكملة مع 14.2 mM NaHCO3، 14.9 mM HEPES، 15٪ تنشيط الحرارة مصل الأبقار الجنين (FBS)، 2٪ L-الجلوتامين، و 0.02٪ كاشف مضاد للميكروبات (انظر جدول المواد)والحفاظ عليها في CO2 حاضنة في 37 درجة مئوية.
- يتم الوصول إلى الخلايا الليفية القلبية حتى 90-95٪ التقاء عند مرور 0 (P0). عند هذه النقطة الخلايا الليفية على استعداد لتقسيمها إلى لوحة 48-جيدا، والذي يستخدم لمجرحة الهجرة.
2 - إعداد لوحة الهجرة
- إعداد لوحة ثقافة خلية 48....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
يوثق هذا الإجراء نهجًا جديدًا لدراسة ترحيل الخلايا، وهو نهج فعال من حيث التكلفة وقابل للتكيف بسهولة بالنسبة لمعظم المختبرات. وقد استخدمت العديد من الدراسات مجهرية الفاصل الزمني لتقييم هجرة الخلايا، ولكن المعدات اللازمة لهذه الطريقة ليست متاحة بسهولة للعديد من المختبرات. في حين أن استخدام خطوط وشرطات لترسيم يسمح لقدرة لاستعادة مناطق محددة من الاهتمام في نقاط زمنية مختلفة دون استخدام معدات باهظة الثمن(الشكل 1 & الشكل 3). وفي حين أن استخدام الترسيمات أمر أساسي .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
هذا النهج الجديد لاختبار الهجرة الصفر يوفر وسيلة أكثر سهولة للباحثين لدراسة التغيرات في هجرة الخلايا. في حين أن هذا الفحص يتبع نفس الإجراء لإدارة خدش مشابه لتشاتد الخدوش الأخرى ، فإنه يوفر طريقة جديدة للتصوير والتحليل الدقيق لهجرة الخلايا10. بدلاً من استخدام أساليب مكثفة المعدات من الوقت الفاصل المجهري والخلايا الحية التصوير غرف، وهذا الأسلوب تفاصيل استخدام معدات المختبر المتاحة عادة. باستخدام المجهر العام المقلوب والكاميرا، يمكن للمرء التقاط صور الهجرة في نفس الوقت مع الحفاظ على ظروف الثقافة متسق.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
ويدعم هذا العمل من قبل جائزة البحوث الطبية للجيش الأمريكي #81XWH-16-1-0710، جامعة ميسيسيبي كلية الصيدلة وقسم العلوم الحيوية.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| Adobe جميع تطبيقات | Adobe | يتضمن هذا Adobe Photoshop وهو برنامج التصوير المستخدم مع هذا البروتوكول | |
| Avant Pipette Tips 200ul Binding غير معقمة | MIDSCI | AVR1 | Tips يتم تعقيمها لتعقيم |
| AxioCam Erc 5s Camera | Zeiss | 426540-9901-000 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Fisher Scientific | BP101-25 | |
| ألواح زراعة الخلايا ذات القاع المسطح من كوستار 48 Wells | Fisher Scientific | 07-200-86 | |
| DMEM مع L-Glutamine و 1 جم / لتر من الجلوكوز وبيروفات الصوديوم | Fisher | Scientific MT10014CM | |
| Image J | NIH | هذا برنامج مجاني تقدمه حكومة الولايات المتحدة وهو برنامج التحليل المستخدم مع هذا البروتوكول | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | AC416785000 | |
| مصل الأبقار الجنيني من أصل أمريكي | ممتاز أبحاث مبتكرة | IFBS-HU | |
| Primocin | InvivoGEN | ant-pm-2 | هذا هو الميكروبات الصارخية المستخدمة مع هذا البروكوتول لزراعة الخلايا الليفية القلبية |
| Zeiss Primovert Microscope | Zeiss | 491206-0002-000 | |
| Zen Blue Edition 2.3 برنامج | يأتي برنامج Zeiss | مع شراء الكاميرا |
المراجع
- Gilbert, S. F. Developmental biology. , Sinauer Associates, Incorporated. (1997).
- Luster, A. D., Alon, R., Von Andrian, U. H. Immune cell migration in inflammation: present and future therapeutic targets. Nature Immunology. 6, (2005).
- Yahata, Y., et al.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
