تقدم هذه المقالة طريقة تجمع بين الالتزام بنخاع العظم بالكامل وفرز قياس التدفق الخلوي لعزل الخلايا الجذعية النخاعية النخاعية من الفك السفلي للفئران وزراعةها وفرزها وتحديدها.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
عزل وزراعة الخلايا الجذعية النخاعية النخاعية النخاعية في الفئران
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
هنا نقدم طريقة فعالة لعزل وزراعة نخاع العظم الفك السفلي الخلايا الجذعية المتوسطة (mBMSCs) في المختبر للحصول بسرعة على العديد من الخلايا عالية الجودة لمتطلبات تجريبية. يمكن استخدام mBMSCs على نطاق واسع في التطبيقات العلاجية كخلايا هندسية للأنسجة في حالة الأمراض القحفية الوجهية وتجديد الوجه والفكين في المستقبل بسبب القدرة الممتازة على التجديد الذاتي وإمكانات التمايز متعددة النسب. لذلك، من المهم الحصول على mBMSCs بأعداد كبيرة.
في هذه الدراسة، تم مسح نخاع العظام من الفك السفلي وتم عزل mBMSCs الأولية من خلال زراعة نخاع العظم كله. وعلاوة على ذلك، تم تنقية CD29+CD90+CD45- mBMSCs من خلال فرز الخلايا الفلورية. تم استخدام الجيل الثاني من mBMSCs المنقى لمزيد من الدراسة وعرض إمكانات في التفريق إلى الأروميات العظمية، والخلايا الدهنية، وخلايا الشوندروسيتي. وباستخدام هذا النموذج في المختبر، يمكن للمرء أن يحصل على عدد كبير من مركبات MBMSCs التكاثرية، مما قد يسهل دراسة الخصائص البيولوجية، والتفاعل اللاحق مع البيئة الدقيقة، وغيرها من تطبيقات مركبات الكربون الهيدروفلورية.
المقدمة
نخاع العظم الخلايا الجذعية المتوسطة (BMSCs) هي الخلايا الجذعية غير الموبوائية المستمدة من نخاع العظام التي تظهر قدرة انتشار قوية وتمايز متعدد النسبالمحتملة 1،2،3،4. في الواقع ، تم اعتبار BMSCs كمرشح مثالي لهندسة الأنسجة العظمية وتجديدها منذ اكتشافها. لسنوات، كانت قمة الحرقفي أو العظام الطويلة مثل الساق وعظم الفخذ المصدر الأكثر شيوعا لBMSCs لتجديد القحف الوجهي. ومع ذلك، فإن مركبات BMSCs الأورو-الوجهية، مثل BMSCs الفك السفلي (mBMSCs)، تظهر بعض الاختلافات عن BMSCs العظام الطويلة، مثل الأصل الجنيني المختلف ونمط النمو. تنشأ الفك السفلي من خلايا ا....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تمت الموافقة على جميع الإجراءات التجريبية الحيوانية في هذه الورقة من قبل لجنة رعاية الحيوان في مستشفى شنغهاي الشعبي التاسع ، كلية الطب بجامعة شنغهاي جياو تونغ.
1. إعداد
- استخدام اثنين من الفئران الذكور سبراغ دولي البالغ من العمر 5 أسابيع للتجربة.
- تعقيم جميع الأدوات، بما في ذلك حاملي الإبر، ملاقط ومقص في درجة حرارة عالية أو مغمورة في الإيثانول 75٪ لمدة 10 دقيقة.
ملاحظة: يجب أن لا يكون الغمر الإيثانول طويلة جدا لتجنب تلف الخلايا. - إعداد وسائل الإعلام الثقافية مسبقا، والتي يتم توفير تكوينها في الجدول 1. تكملة كل وسيلة على النحو المبين أدناه.
- إعداد α-MEM ثقافة المتوسطة (مع 10٪ FBS): تكملة ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
باستخدام هذا البروتوكول، انضمت نسبة كبيرة من الخلايا إلى اللوحة في اليوم الثالث بعد الثقافة الأولية. عادة، بعد 3-4 أيام إضافية من الثقافة، وصل التقاء الخلية إلى 70 إلى 80٪(الشكل 1B). مع فرز الخلايا الفلورية، تم تنقية DAPI-CD29+CD90+CD45- mBMSCs18،22، والتي شكلت حوالي 81.1٪ في خلايا P0 (الشكل 1C).
بعد البذر P2 mBMSCs في 100 خلية في كل.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يصف هذا البروتوكول طريقة لعزل BMSCs من الفك السفلي للفئران في المختبر من خلال الجمع بين الالتزام بنخاع العظم الكامل وفرز الخلايا الفلورية ، وهي طريقة بسيطة وموثوقة للحصول على mBMSCs التكاثرية بقدرة تمييز قوية. يمكن لهذه الطريقة تنقية mBMSCs بشكل أولي عن طريق فرز خلايا التدفق ، ولكن إذا كانت هناك متطلبات أعلى لتجانس الخلايا ، فقد تكون هناك حاجة إلى طرق تنقية أكثر دقة.
حاليا، هناك أربع تقنيات رئيسية تستخدم لعزل mBMSCs، بما في ذلك الالتزام نخاع العظام كله، والطرد المركزي الانحدار الكثافة، وفرز ال.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
جميع المؤلفين يقولون أنه ليس لديهم تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
نشكر على مساعدة مختبر أمراض الفم الرقمية ومركز البحوث للتشوهات القحفية الوجهية في مستشفى الشعب التاسع في شنغهاي. يدعم عمل هذه المخطوطة منح من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية الصينية (NSFC) [81570950,81870740,81800949], شنغهاي قمة وهضبة التخصصات، صندوق SHIPM-mu من معهد شنغهاي للطب الدقيق، شنغهاي مستشفى الشعب التاسع، شنغهاي جياو تونغ كلية الطب جامعة [JC201809]، المشروع الحافز لفريق الابتكار رفيع المستوى لكلية الطب في جامعة جياو تونغ شنغهاي. و ل. ج. هو باحث في برنامج تنمية الشباب المتميز للمواهب الطبية للشباب، وبرنامج شنغهاي "النجوم الصاعدة للمواهب الطبية" لتنمية الشباب، ومشروع "تشن شينغ" من جامعة جياوتونغ في شنغهاي.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 0.25٪ Trypsin-EDTA (1X) | Gibco | 25200072 | |
| طبق ثقافة 10 سم | Corning | ||
| acutenaculum | |||
| Adipogenic التمايز المتوسط | Cyagen biosciences inc. | MUBMX-90031 | |
| Alcian Blue | Beyotime Biotechnology | ||
| Alizarin red | Sigma-Aldrich | A5533 | |
| مجموعة تطوير ألوان الفوسفاتيز القلوية | Beyotime | Biotechnology C3206 | |
| alpha-Minimum أساسية متوسطة | GE Healthcare HyClone Cell | Culture SH30265.01B | |
| Anti -CollagenII Rabbit pAb | Abcam | ab34712 | |
| الأجسام المضادة ضد CD16 / CD32 | |||
| التركيب المضاد للتلاشي مع DAPI | Beyotime Biotechnology | P0131 | |
| APC مضاد للماوس / الفئران CD29 الأجسام المضادة | biolegend inc | 102215 | |
| خزانة السلامة الحيوية | Esco | AC2-4S8-CN | |
| CD45 الأجسام المضادة وحيدة النسيلة (OX1) ، PE ، eBioscience | Invitrogen | 12-0461-82 | |
| CD90.1 (Thy-1.1) الجسم المضاد أحادي النسيلة (HIS51) ، FITC ، eBioscience | Invitrogen | 11-0900-85 | |
| أجهزة الطرد المركزي | Cence | L500 | |
| تمايز الغضروف المتوسطة | cyagen biosciences inc. | ||
| مجهر المسح الضوئي بالليزر متحد البؤر | Zeiss | LSM880 | |
| Countess II FL عداد الخلايا الآلي | Invitrogen | AMQAF1000 | |
| حل تلطيخ البنفسجي الكريستالي | Beyotime Biotechnology | C0121 | |
| مصل الأبقار الجنيني | GE Healthcare HyClone Cell Culture | SH30084.03 | |
| الماعز المضادة للأرانب IgG H& L (Alexa Fluor 488) | abcam | ab150077 | |
| حاضنة | Esco | CCL-170B-8 | |
| مجهر مقلوب | أوليمبوس | CKX53 | |
| كاشف ماغزول (كاشف Trizol) | |||
| ماصة دقيقة | زيت إيبندورف | ||
| أحمر O | |||
| وسط التمايز العظمي | شركة سياجين للعلوم البيولوجية | MUBMX-90021 | |
| البنسلين ستربتومايسين | جيبكو | 15070063 | |
| محلول ملحي مخزن بالفوسفات (1X) | Gibco | 20012027 | |
| PrimeScript RT Master Kit | TakaRa Bio Inc | RR036A | |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | P6556 | |
| QuickBlock Blocking Buffer | Beyotime Biotechnology | P0260 | |
| مقص | |||
| SYBR1 بريميكس | TakaRa Bio Inc | ||
| تولويدين الأزرق | Beyotime التكنولوجيا | ||
| الحيوية Trypan Blue Solution ، 0.4٪ | Gibco | 15250061 |
المراجع
- Jin, C., et al. Stem cell education for medical students at Tongji University: Primary cell culture and directional differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells. Biochemistry and Molecular Biology Education. 46 (2), 151-154 (2018).
- Chu, D. T., et al.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
