ウイルス感染後、腎臓は比較的多数のCD8+T 細胞を収容し、非粘膜TRM 細胞を研究する機会を提供する。ここでは、フローサイトメトリー解析のためにマウス腎臓リンパ球を単離するプロトコルについて述べた。
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この記事について
サマリー
要約
組織常駐記憶T細胞(TRM)は、免疫学研究の急速に拡大する分野である。T細胞を様々な非リンパ組織から分離することは、TRMsを調査するための重要なステップの1つです。異なる臓器のリンパ球分離プロトコルにはわずかなバリエーションがあります。腎臓は、特に病原体暴露または自己免疫活性化後に多数の免疫細胞浸潤を有する必須の非リンパ器官である。近年、私たち自身を含む複数の研究室は、マウスと人間の両方で様々な生理学的および病理学的な設定で腎臓常駐CD8+ T細胞の特徴付けを開始しました。Tリンパ球の豊富さのために、腎臓は非粘膜または非バリア組織でTRMsを研究する魅力的なモデル器官を表す。ここでは、全身ウイルス感染後のマウス腎臓からCD8+ T細胞を単離するためにTRM-焦点を当てたラボで一般的に使用されるプロトコルについて説明する。簡単に言えば、C57BL/6マウスにおける急性リンパ球性絨毛髄膜炎ウイルス(LCMV)感染モデルを用いて、血管内CD8+T細胞標識、酵素消化、および密度勾配遠心分離を実証し、マウス腎臓からのリンパ球を分離および濃縮し、その後のフロー細胞量分析の準備を整える。
概要
組織常駐記憶(TRM)T細胞は、成人ヒトおよび感染マウスにおいて最も豊富なT細胞集団の1つを表す。TRM細胞は免疫防御の第一線を提供し、様々な生理学的および病理学的プロセス1、2、3、4、5に批判的に関与している。T細胞を循環する細胞と比較すると、TRM細胞はユニークな転写プログラム6、7、8を持つ明確な表面マーカーを運ぶ。TRM生物学に関する知識を広げ、T細胞ベースワクチンや免疫療法の将来の開発に不可欠なT細胞応答を理解する鍵です。
TRMsの一般的に共有される分子マーカーは、すべての非リンパ組織にまたがって、組織特異的な特徴がTRM生物学9の中心的な構成要素であることを示唆する証拠を蓄積す....
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プロトコル
このプロトコルに従って行われるすべての動物実験は、それぞれの機関の動物のケアと使用委員会(IACUC)によって承認されなければなりません。ここに記載されているすべての手順は、IACUC UT健康サンアントニオによって承認されています.
1. C57BL/6レシピエントおよびLCMV感染へのP14 T細胞の養子転移
- P14マウスを6-12週齢で使用する。ドナーP14 TCRトランスジェニックマウスの性別がC57BL/6レシピエントマウスの性別と一致する必要があることを確認してください。さもなければ、雌マウスに移る雄T細胞のような細胞は、14日目頃に循環ドナーT細胞の免疫媒介拒絶をもたらす。
- メーカーのプロトコルに従ってマウスCD8+ T細胞精製キットを使用して、P14 TCRトランスジェニックマウスの脾臓およびリンパ節からナイーブCD8+ T細胞を精製します。
- 簡単に言えば、脾臓およびリンパ節を解剖し、サンプルをつぶして単一細胞懸濁液を生成する。
- ナイーブT細胞を濃縮するために、第1の抗体インキュベーションステップ13の間にビオチン抗CD44抗体を添加する。
注:このステップで使用されるネガティブセレクション用の市販キットには、インキュベーションの2つのステ....
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結果
ここで説明するプロトコルはフローチャートに要約されています (図 1A)。30日目のLCMV感染後、CD8+T細胞の血管内標識を行った。5分後、動物の両方の腎臓を解剖し、みじん切りにし、コラゲターゼ消化を行った。リンパ球はパーコール遠心分離を介して消化されたサンプルからさらに精製し、フローサイトメトリーによって分析した。図1Bに示すように、密度遠心分離媒介リンパ球濃縮後も、最終製品において非リンパ球の大部分を見るのは非常に一般的であった。しかし、生きたリンパ球でギートした後、CD8+Tリンパ球を同定することは容易であった。血管内対血管外CD8+T細胞を区別することができた。CD8+T細胞上のCD8αおよびCD8βの高相関発現パターンにより、血管内CD8+T細胞がCD8α-CD8βFACSプロファイル上に対角線パターンを示すことが期待される。予想通り、血管外CD8+T細胞のみが効率的に
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ディスカッション
組織特異的免疫は急速に拡大する研究領域であるため、証拠を蓄積すると、免疫細胞、特にリンパ球集団は、成人ヒトまたは感染または免疫マウスのほぼすべての器官で同定できることを示唆している。LCMVマウス感染モデルは、複数の組織にわたるTRM 生物学を含む抗原特異的T細胞応答、エフェクターおよびメモリT細胞分化を研究するための確立されたモデルである。ここでは、腎臓におけるCD8+T 細胞を解析するプロトコルについて説明した。このプロトコルは、主に TRM12に焦点を当てた出版物から適用されます。高レベルのP2RX7発現および酵素消化誘導細胞死15に起因すると考えられるが、現在のプロトコルからのリンパ球収量は、即時表現型分析に最も適している。しかし、P2RX7誘導細胞死16を阻害するプロトコルを確立すると、現在のプロトコルを容易に改変できること(例えば、P2RX7シグナルを遮断する阻害剤を添加して)細胞の生存を増加させ、他の長期機能アッセイ.......
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開示事項
著者らは関連する財務上の開示を持っていません。
謝辞
この研究は、NIHがAI125701およびAI139721、がん研究所CLIPプログラム、米国癌学会がRSG-18-222-01-LIBをN.Zに付与することを支援しています。フローサイトメトリー施設のカーラ・ゴレナとセバスチャン・モンタニーノに感謝します。フローサイトメトリー共有資源施設で生成されたデータは、テキサス大学サンアントニオ保健科学センター(UTHSCSA)、NIH/NCI助成金P30 CA054174-20(UTHSCSAの臨床およびトランスレーショナル研究センター[CTRC])、およびUL1 TR001120(臨床および翻訳科学賞)によって支えられました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 1.5 ml 微量遠心チューブ | フィッシャーブランド | 05-408-130 | |
| 15 ml コニカルチューブ | コーニング | 431470 | |
| 3 ml シリンジ | BD | 309657 | |
| 37C インキュベーター | VWR | ||
| ビオチン a-CD8a 抗体(クローン 53-6.7) | とんぼバイオサイエンス | 30-0081-U025 | |
| 子牛血清 | GE ヘルスケアライフ科学 | SH30073.03 | |
| Collegenase B | Millipore Sigma | 11088807001 | |
| 使い捨て目盛り付きトランスファーピペット | Fisherbrand | 13-711-9AM | |
| インスリン注射器 | BD 329424 | ||
| マイクロ解剖スプリングハサミ | Roboz Surgical | RS 5692 | |
| Mojosort マウス CD8 Naïve T 細胞単離キット | Biolegend | 480043 | |
| オーバーヘッド ヒート ランプ | アマゾン | B00333PZZG | |
| PBS | |||
| パーコール | GE ヘルスケア ライフサイエンス | 17089101 | |
| ロッカー | VWR | ||
| RPMI | GE ヘルスケア ライフサイエンス | SH30096.01 | |
| 真鍮製マウスRestrainer | Braintree Scientific、Inc | SAI-MBR | |
| スイングバケット遠心分離機、冷蔵庫付き | サーモフィッシャー | ||
| 組織培養6ウェルプレート | Corning | 3516 |
参考文献
- Mueller, S. N., Gebhardt, T., Carbone, F. R., Heath, W. R. Memory T cell subsets, migration patterns, and tissue residence. Annual Review of Immunology. 31, 137-161 (2013).
- Mueller, S. N., Mackay, L. K. Tissue-resident memory T cells: local specialis....
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再版と許可
