Method Article

Включение компенсации в режиме реального времени в быстрых фотохимических окислениях белков для определения изменений топографии белка

DOI:

10.3791/61580

⸱

September 1st, 2020

 , 
1Department of Biomolecular Sciences, University of Mississippi, 2Department of Chemistry and Biochemistry, University of Mississippi, 3GenNext Technologies, Inc.

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Быстрое фотохимическое окисление белков является новым методом структурной характеристики белков. Различные растворители добавок и лигандов имеют разнообразные гидроксиловые радикальные свойства очистки. Для сравнения структуры белка в различных условиях для нормализации реакции требуется компенсация в режиме реального времени гидроксиловых радикалов, генерируемых в реакции.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Быстрое фотохимическое окисление белков (FPOP) является методом структурной биологии на основе масс-спектрометрии, который зондирует доступную к растворителям поверхностную область белков. Этот метод опирается на реакцию аминокислотных боковых цепей с гидроксильными радикалами, свободно рассеивающихся в растворе. FPOP генерирует эти радикалы на месте с помощью лазерного фотолиза перекиси водорода, создавая взрыв гидроксиловых радикалов, который истощается в порядке микросекунды. Когда эти гидроксиловы радикалы реагируют с растворителем доступной аминокислотной боковой цепи, реакционные продукты демонстрируют массовый сдвиг, который может быть измерен и количественно масс-спектрометрии. Поскольку скорость реакции аминокислоты частично зависит от средней доступной поверхности растворителя этой аминокислоты, измеренные изменения в количестве окисления данной области белка могут быть непосредственно связаны с изменениями в доступности растворителя этого региона между различными конформациями (например, лиганд-связанных по сравнению с лиганд-бесплатно, мономер против агрегата и т.д.) FPOP был применен в ряде проблем в биологии, в том числе белково-белковых взаимодействий, белковых конформациальных изменений, а также связывания белка-лиганда. Поскольку доступная концентрация гидроксиловых радикалов варьируется в зависимости от многих экспериментальных условий в эксперименте FPOP, важно контролировать эффективную радикальную дозу, которой подвергается белковый аналит. Этот мониторинг эффективно достигается путем включения inline дозиметра для измерения сигнала от реакции FPOP, с лазерным гриппом регулируется в режиме реального времени для достижения желаемого количества окисления. С помощью этой компенсации изменения в топографии белка, отражающие конформацию изменений, лиганд-связывающих поверхностей, и / или белково-белкового взаимодействия интерфейсы могут быть определены в неоднородных образцов с использованием относительно низкого количества выборки.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Быстрая фотохимическая окисление белков (FPOP) является новым методом определения топографических изменений белка сверхбыстрой ковалентной модификацией поверхности растворителя, за которой следует обнаружение LC-MS1. FPOP генерирует высокую концентрацию гидроксиловых радикалов на месте с помощью ультрафиолетового лазерного флэш-фотолиза перекиси водорода. Эти гидроксиловые радикалы очень реактивны и недолговечны, потребляются примерно на микросекундной шкале времени в условиях FPOP2. Эти гидроксиловые радикалы рассеиваются через воду и окисляют различные органические компоненты в растворе с кинетической скоростью, как пр....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовка оптической скамьи и капилляра для FPOP

ВНИМАНИЕ: KrF excimer лазеры являются крайними опасностями для глаз, и прямой или отраженный свет может привести к необратимому повреждению глаз. Всегда носите соответствующую защиту глаз, избегайте присутствия любых отражающих объектов вблизи пути луча, когда это возможно, и используйте инженерные элементы управления для предотвращения несанкционированного доступа к активному лазеру и для сдерживания любых бродячих отражений.

  1. Подготовь оптическую скамейку FPOP.
    1. Включите лазер, чтобы согреться. Установите лазер на внешний триггер, постоянная энергия, без замены газа. Уст....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Сравнение тяжелой цепи пептидного следа адалимумаба биоаналога в фосфатном буфере и при нагревании при 55 градусов по Цельсию на 1 ч показывают интересные результаты. Студенческий т-тест используется для идентификации пептидов, которые существенно изменились в этих двух условиях (p ≤ 0.05). Пептиды 20-38, 99-125, 215-222, 223-252, 260-278, 376-413 и 414-420 показывают значительную защиту от растворителя при нагревании белка для формирования агрегатов(рисунок 5)30. В х.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Массовые спектрометрические структурные методы, в том числе водород-дейтерийный обмен, химическая перекрестная связь, ковалентная маркировка, а также родная масс-спектрометрия и ионная мобильность быстро растут в популярности из-за их гибкости, чувствительности и способности обрабатывать сложные смеси. FPOP может похвастаться несколькими преимуществами, которые повысили его популярность в области массовой спектрометрии на основе структурных методов. Как и большинство ковалентных стратегий маркировки, он обеспечивает стаб.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Джошуа С. Шарп раскрывает значительный финансовый интерес к GenNext Technologies, Inc., небольшой компании, стремятся коммерциализировать технологии для анализа структуры высшего порядка белка, включая гидроксил радикальный белок след.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы признаем финансирование исследований от Национального института общих медицинских наук грант R43GM125420-01 для поддержки коммерческой разработки скамейки FPOP устройства и R01GM127267 для разработки стандартизации и дозиметрии протоколов для высокой энергии FPOP.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
АденинAcros Organics147440250растворим в воде до 3,5 мМ
АпертураEdmund Optics39-9051000 μ m Диаметр апертуры, позолоченная медь
Держатель апертурыEdmund Optics53-28725,8 мм Внешний диаметр, прецизионное крепление для обскуры
CatalseSigma AldrichC-40Каталаза из бычьей печени, лиофилизированный порошок и т.д.; 10 000 ед./мг белка
COMPex Pro лазерCoherent1113836COMPexPRO 102, F-Vversion, лазер KrF, без XeCl
дитиотеитол (DTT)PromegaV3151DTT, молекулярный (DL-дитиотреит)
Сборник фракцийGenNext Technologies, Inc.Н/ДАвтоматизированный коллектор фракций
Капиллярная трубка из плавленого кремнеземаMolex1068150023Гибкая капиллярная трубка из плавленого кремнезема, внутренний диаметр 100 &; m, наружный диаметр 375 & микро; m, TSP100375
глютаминAcros Organics119951000L(+)-глютамин, 99%
Держатель для линзыEdmund Optics03-66853 мм Внешний диаметр, трехвинтовое регулируемое кольцевое крепление
Перекись водородаFisher ScientificH325-100Перекись водорода, 30% (сертифицированный ACS), система Fisher Chemical
LC-MS/MS ThermoScientificIQLAAEGAAPFADBMBCXDionex Ultimate 3000 в сочетании с масс-спектрометром Orbitap Fusion Tribrid
Mas АцетонитрилFisher ScientificA955-1Ацетонитрил, Optima LC/MS Grade, Fisher Chemical
Mass spec муравьиная кислотакласса Fisher ScientificA117-50Муравьиная кислота, 99,0+%, Optima™ Класс LC/MS, Fisher Chemical
Mass spec ВодаFisher ScientificW6-4Вода, Optima LC/MS Grade, Fisher Chemical
MES буферSigma AldrichM0164MES геминатриевая соль
Метионин амидBachem4000594.0005H-met-NH2. Зажим HCl
Micro V ThorLabsVK250Micro V-образный зажим с лезвиями из нержавеющей стали
Моторизованная сценаEdmund Optics68-63850 мм Ходовая моторизованная сценическая система с ручным управлением
Nano C18 колумThermo Scientific164534Acclaim PepMap 100 C18 Колонны ВЭЖХ
Оптическая скамейкаEdmund Optics56-93518" x 18"
Пионерская модульная система FPOPGenNext Technologies, Inc.Н/ДВстроенный FPOP Radical Dosimetry System
Держатель столбаEdmund Optics58-9793 дюйма длина, ¼-20 Резьба, Держатель столба
Фосфат натрия двухосновнойFisher ScientificBP331-500Фосфат натрия двухосновной гептагидрат (бесцветные до белых кристаллов), Fisher BioReagents
Фосфат натрия одноосновнойFisher ScientificBP330-500Моноосновной моногидрат фосфата натрия (кристаллы от бесцветного до белого цвета), шприц Fisher BioReagents
Hamilton81065100 &; L, Модель 1710 RN SYR, Малый съемный NDL, 22s ga, 2 дюйма, точечный тип 3
Шприцевой насосKD Scientific788101Legato  101 шприцевой насос
Ловушка C18 колоннаThermo Scientific160454Thermo Scientific  Acclaim PepMap 100 C18 ВЭЖХ колонки
TrisSigma Aldrich252859трис(гидроксиметил)аминометан
трипсинPromegaV5111Секвенирование класса модифицированный трипсин
УФ плоская выпуклая линзаEdmund Optics84-28530 мм Диаметр x 120 мм FL Без покрытия, УФ-плоско-выпуклая линза
класса макетная плата

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kaur, P., Kiselar, J., Yang, S., Chance, M. R. Quantitative protein topography analysis and high-resolution structure prediction using hydroxyl radical labeling and tandem-ion mass spectrometry (MS). Molecular & Cellular Proteomics. 14 (4), 1159-1168 (2015).
  2. Hambly, D. M., Gross, M. L.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Fast Photochemical OxidationProtein TopographyHydroxyl Radical DosimetryReal Time CompensationInline DosimeterLaser Fluence AdjustmentProtein Conformational ChangesMass Spectrometry AnalysisSolvent AccessibilityCapillary Electrophoresis

Related Articles