عدوى الفئران حديثي الولادة مع الإنارة الحيوية E. القولونية O1:K1:H7 يؤدي إلى عدوى الصرف الصحي مع التهاب رئوي كبير وأمراض الرئة. هنا، نحن وصف إجراءات لنموذج ومواصلة دراسة الإنتان الوليد باستخدام التصوير داخل الرحم الطولي بالتوازي مع تعداد الأعباء البكتيرية النظامية، التنميط الالتهابي، وعلم الأنسجة الرئوية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
نموذج تصوير حديثي الولادة من تعفن الدم البكتيري السلبي للجرام
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يتعرض الولدان لخطر متزايد للإصابة بالإنتان البكتيري بسبب الملامح المناعية الفريدة التي يعرضونها في الأشهر الأولى من الحياة. لقد أنشأنا بروتوكولا لدراسة التسبب في الإمراض من E. القولونية O1:K1:H7، وهو نوع المصلي المسؤول عن ارتفاع معدلات الوفيات لدى الأطفال حديثي الولادة. تستخدم طريقتنا التصوير داخل الرحم للجراء الوليدية في نقاط زمنية مختلفة أثناء تطور العدوى. هذا التصوير، بالتوازي مع قياس البكتيريا في الدم، التنميط الالتهابي، وعلم الأنسجة الأنسجة، يدل على نهج صارم لفهم ديناميات العدوى أثناء الإنتان. في هذا التقرير، نحن نموذج اثنين من inoculums المعدية للمقارنة بين الأعباء البكتيرية وشدة المرض. نجد أن العدوى تحت الكتف تؤدي إلى العدوى التي تنتشر من قبل 10 ح بعد العدوى. بواسطة 24 ساعة، عدوى الإشريكية القولونية الإنارة كانت وفيرة في الدم والرئتين والأنسجة الطرفية الأخرى. التعبير عن السيتوكينات الالتهابية في الرئتين مهم في 24 ساعة ، ويتبع ذلك تسلل خلوي ودليل على تلف الأنسجة يزيد مع الجرعة المعدية. التصوير داخل الرحم لديه بعض القيود. وهذا يشمل عتبة إشارة الإنارة وبعض المضاعفات التي يمكن أن تنشأ مع حديثي الولادة أثناء التخدير. على الرغم من بعض القيود، نجد أن نموذج العدوى لدينا يقدم نظرة ثاقبة لفهم ديناميات العدوى الطولية خلال تعفن الرحم الوليد، التي لم يتم فحصها بدقة حتى الآن. ونتوقع أيضا أن يتم تكييف هذا النموذج لدراسة الالتهابات البكتيرية الحرجة الأخرى خلال الحياة المبكرة.
المقدمة
تعفن الدم البكتيري هو مصدر قلق كبير لحديثي الولادة التي تظهر صورة مناعية فريدة في الأيام الأولى من الحياة التي لا توفر الحماية الكافية من العدوى1. لا يزال الإنتان الوليدي مشكلة كبيرة في الرعاية الصحية في الولايات المتحدة تمثل أكبر من 75,000 حالة سنويًا في الولايات المتحدة وحدها2. لدراسة هذه العدوى في العمق، هناك حاجة إلى نماذج حيوانية جديدة تُكاب في أشكال من أمراض الإنسان. لقد أنشأنا نموذج عدوى الماوس الوليدية باستخدام Escherichia القولونية، O1:K1:H73. الإشريكية القولونية هي السبب الرئيسي الثاني لتعفن الدم الوليدي في الولايات المتحدة، ولكنها مسؤولة عن غالبية الو....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
وقد تمت الموافقة على جميع الإجراءات من قبل اللجان المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها في ولاية فرجينيا الغربية والتي أجريت وفقا لتوصيات من دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية من قبل المجلس الوطني للبحوث18.
1. إعداد Inoculum البكتيرية
- Streak a Tryptic soy agar (TSA) لوحة مع حلقة تلقيح لعزل مستعمرة واحدة من مخزون الفريزر من E. القولونية O1:K1:H7-لوكس التي تعبر بشكل ثابت luciferase ويحمل kanamycinالمقاومة 3. احتضان ليلة وضحاها في 37 درجة مئوية.
- في اليوم التالي تسمح مرق لوريا (LB) أن تأتي إلى درجة حرارة الغرفة (25 درجة مئوية) في مجلس الوزراء السلامة الأح....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
هذا البروتوكول تسبب في الإنتان البكتيري في الفئران حديثي الولادة، واستخدمنا التصوير داخل الرحم الطولي، تعداد البكتيريا في الدم، والتقييمات النسيجية لعلم الأمراض، وملامح التعبير السيتوكينية الالتهابية لدراسة مسار المرض. وقد لوحظت علامات المراضة في الجراء الوليدية المصابة بكل من منخفضة (~ 2 × 106 CFUs) وعالية (~ 7 × 106 CFUs) أُنكوس من الإشريكية القولونية مع مرور الوقت. الجراء التي تلقت أكبر inoculum عرض علامات أكثر بروزا من الضيق التي شملت انخفاض الحركة، وعدم القدرة على تصحيح موقفهم، وضعف ال.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
نموذج العدوى تحت كابيكال لدينا لتحفيز تعفن البكتيريا في الفئران حديثي الولادة هو طريقة جديدة لدراسة الانتشار الطولي للمسببات البكتيرية في الوقت الحقيقي. يوفر التصوير داخل الرحم الفرصة لاستكشاف الانتشار البكتيري في الوقت الحقيقي في حديثي الولادة. وهذا أمر بالغ الأهمية لفهم حركية الانتشار البكتيري ومواصلة دراسة استجابة المضيف وتلفه في المرحلة المناسبة من المرض. الجراء الماوس تدار تحت الجلد، حقن تحت الكتف من inoculum البكتيرية. تقنية الحقن هذه أبسط من البدائل الأخرى الشائعة الاستخدام، مثل وريد الذيل والالتهابات داخل الصفاق،.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ولا يوجد لدى أصحاب البلاغ أي تضارب في المصالح للكشف عنه.
شكر وتقدير
وقد دعم هذا العمل من قبل صناديق مؤسسية إلى C.M.R.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 1 مل حقنة الأنسولين | Coviden | 1188128012 | حقن اللقاح أو PBS |
| 10٪ محايد مخزن الفورمالين | VWR | 89370-094 | علم الأنسجة |
| ACK تحلل العازلة | Gibco | LSA1049201 | فحص التصفية البكتيرية |
| معجون حبر الوشم الحيواني | Ketchum | KI1482039 | تحديد |
| حبر الوشم الحيواني معجون أخضر | Ketchum | KI1471039 | تحديد |
| Anti-Ly-6B.2 Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-100-781 | عزل الخلية |
| الإشريكية القولونية< / em> O1: K1: H7 | ATCC | 11775 | |
| الإشريكية القولونية< em> O1: K1: H7-lux< / em> (يعبر عن لوسيفيراز) | N / A | N / A | تم إنشاؤه داخليا في WVU |
| E.Z.N.A. HP مجموعة الحمض النووي الريبي للاستخراج | الكلي أوميغا Bio-tek | R6812 | RNA extration |
| DPBS ، 1X | Corning | 21-031-CV | |
| Difco Tryptic Soy Agar | Becton و Dickinson and Company | 236950 | نمو بكتيري |
| IL-1 beta Primer / Probe (Mm00434228) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | تعبير السيتوكين qPCR |
| IL-6 التمهيدي / المسبار (Mm00446190) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | تعبير السيتوكين qPCR |
| iQ Supermix | Bio-Rad | 1708860 | الكمي في الوقت الحقيقي PCR |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 1708891 | تخليق (كدنا |
| عازلة العازلة | Miltenyi Biotec | N / A | مقايسة التصفية البكتيرية |
| IVIS الطيف المقطع والصورة الحية 4.5 برنامج | Perkin Elmer | N / A | التصوير داخل الحياة |
| LB مرق ، لينوكس | فيشر الكواشف الحيوية | BP1427-500 | نمو البكتيريا |
| EASYstrainer (سلة النايلون) | Greiner Bio-one | 542 040 | مصفاة الخلايا |
| SpectraMax iD3 | الأجهزة الجزيئية | N / A | قارئ لوحة |
| بيليه مدقة موتور | Grainger | 6HAZ6 | تجانس الأنسجة |
| بيليه البولي بروبيلين بيليه Pestles | Grainger | 6HAY5 | تجانس الأنسجة |
| Prime Thermal Cycler | Techne | 3PRIMEBASE / 02 | (cDNA) تخليق |
| TNF-alpha التمهيدي / المسبار (Mm00443258) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | تعبير السيتوكين qPCR |
| TriReagent (GTCP) | مركز البحوث الجزيئية | TR 118 | RNA extration |
المراجع
- Qazi, S. A., Stoll, B. J. Neonatal sepsis: a major global public health challenge. Pediatr Infect Dis J. 28, 1-2 (2009).
- Simonsen, K. A., Anderson-Berry, A. L., Delair, S. F., Davies, H. D. Early-onset neonatal sepsis. Clinical Microbiology Reviews. 27 (1), 21-47 (2014). <....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
