소 난소 피질의 체외 문화와 난소 미세 환경에 대한 영양 계단 단계 식단의 효과가 제시됩니다. 난소 피질 조각7 일 동안 배양 하 고 스테로이드, 사이토 카인, 그리고 여포 단계 평가 되었다. 계단 단계 다이어트 치료는 문화에서 여포 진행의 결과로 증가 스테로이드 발생했다.
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이 논문에서
요약
초록
초보에서 antral 단계로의 여포 발달은 체세포 및 적혈구 세포-oocyte 통신에서 내분비 및 파라크리인을 포함하는 난소 피질 내의 동적 과정입니다. 난소 미세 환경과 주변 밀리에서 생산 된 사이토카인과 스테로이드가 여포 진행 또는 체포에 미치는 영향에 대해서는 거의 알려져 있습니다. 난소 피질의 체외 배양은 여포가 인접한 스트로마에 의해 지원되는 정규화된 환경에서 발전할 수 있게 합니다. 우리의 목표는 소난소 피질의 체외 문화를 통해 난소 미세 환경 (여포 발달, 스테로이드 및 사이토카인 생산)에 영양 계단 단계 식단의 효과를 결정하는 것이었습니다. 이를 위해 난소 피질 조각은 사춘기 이전에 두 가지 영양학적으로 개발된 두 가지 영양학적 개발 체계를 겪고 있는 하이퍼에서 제거되었습니다: 제어(전통적인 영양 발달) 및 Stair-Step(개발 중 의 먹이 주기 및 제한) 약 0.5-1mm3개로 절단되었습니다. 이 조각들은 이후 일련의 세차를 통과하고 웨이머스의 배양 배지를 잘 포함하는 조직 배양 삽입에 배치되었다. 난소 피질은 매일 문화 매체의 변화와 함께 7 일 동안 배양되었다. 조직학적 단면은 추가 치료 없이 영양의 영향과 문화의 영향을 결정하기 위해 문화 전후의 여포 단계 변화를 결정하기 위해 수행되었다. 피질 배양 배지 스테로이드를 측정 하기 위해 일 동안 풀링 되었다, 스테로이드 대사 산물, 그리고 사이토 카인. 난소 미세 환경에서 증가 된 스테로이드 호르몬에 대 한 경향이 있었다 제어 난소 피 질 배양 대 계단 에서 여포 진행을 허용. 난소 피질 배양 기술은 난소 미세 환경의 더 나은 이해를 허용하고, 내분비 분비의 변경이 생체 및 체외 치료 모두에서 여포 진행과 성장에 영향을 미칠 수있는 방법. 이 문화 방법은 또한 비옥을 승진시키기 위하여 여자에 있는 여포 진행을 향상할 수 있는 잠재적인 치료시험을 위한 유익한 증명할 수 있습니다.
서론
난소 피질은 여포 발달이 발생하는 난소의 외부 층을 나타냅니다1. 처음에 개발에서 체포 된 원시 여포는 파라크리네 및 생식샘 호르몬 입력1,2,3,4에기초한 원차, 보조 및 다음 항제 또는 삼차 여포로 활성화됩니다. 난소 내의 생리적 과정을 더 잘 이해하기 위해 조직 배양은 체외 모델로 사용될 수 있으므로 조절된 환경이 실험을 수행할 수 있습니다. 많은 연구가 보조 생식 기술, 불임 보존 및 난소암5,6,7의연구를 위해 난소 조직 문화를이용했습니다. 난소 조직 배양은 또한 난소 건강을 손상시키는 생식 독소를 조사하는 모델로 사용되었으며 다낭성 난소 증후군 (PCOS)8,9,10,
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프로토콜
난소는 미국 육류 동물 연구 센터16에서수득하였다. 앞서 언급한 바와같이,농업 연구 및 교육에서 농업 동물의 관리 및 사용에 대한 지침에 따라 미국 육류 동물 연구 센터 (USMARC) 동물 관리 및 사용위원회에 의해 모든 절차가 승인되었습니다. 난소는 네브래스카 링컨 생식 연구소로 옮겨졌으며, 그곳에서 가공되고 배양되었습니다.
1. 필수 미디어 준비
-
웨이머스 MB 752/1 매체
- 멸균 수의 900mL로 1 L 티슈 배양 병을 채웁니다. 물이 교반 판에 부드럽게 저어주면서 가루 를 점차적으로 넣습니다. 분말 매체가 용해되면 중탄산나트륨 2.24g을 넣고 소세럼 알부민(BSA)을 1.25g씩 첨가한다. pH 미터를 사용하고 pH를 7.25-7.35로 조정합니다. 멸균 물을 추가하여 최종 부피를 1L로 가져옵니다.
- 생물학적 안전 캐비닛으로 이동하고 배지의 0.1 % v / v의 농도에 페니실린 연쇄 상균 황산염을 추가합니다. 0.22 μm 모공 33.2cm2 500 mL 병 상단 필터로 매체를 필터링합니다.
- 여과된 배지를 여러 50mL ....
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결과
이 소 피질 배양 절차는 난소의 작은 조각에서 호르몬, 사이토카인 및 작사학 데이터의 다양한 을 결정하기 위하여 이용될 수 있습니다. 헤마톡시린 및 에오신(H&E)과 같은 염색은 여포 스테이징16,23,31(도 3)을통해 난소 형태를 결정하는 데 사용될 수 있다. 간략하게, 여포는 원형으로 분류되었다, 이는 편평상피 전 과립 세포의 단일 층으로 둘러싸인 난모세포 (0); 과도기 여포 또는 초기 1 차, 주로 편평상피 전 과립 세포와 일부 입체 과립 세포에 의해 포위 된 난모세포 (1); 1 차포, 1-1.5 층의 입체 과립 세포 (2)에 둘러싸인 난모입니다; 이차 여포는 두 개 이상의 입체 과립 세포 (3)에 둘러싸여 있는 난모세포입니다. 직경 이 1mm 이하이며 뚜렷한 antrum(4)
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토론
이 원고에 설명된 바와 같이 체외 난소 피질 문화의 장점은 여포를 둘러싼 인접한 기질이 있는 정상화된 환경에서 여포가 발전한다는 것입니다. 체세포 및 난소세포는 그대로 유지되며 생체 내 모델으로서 적절한 세포 간 통신이 있다. 우리의 실험실은 7 일 문화 시스템이 난소 피질의 처리를 위한 대표적인 여포 신생 및 스테로이드 발생 데이터를 제공한다는 것을 것을을 발견했습니다. 다른 난소 조직 배양 프로토콜은 10-15일5,6,10의문화권 기간이 1-6일7,32일 또는 긴 배양 기간을 갖는다. 그러나, 우리는 7 일 이상 배양 조직 저하에 이르게 관찰, 감소 된 스테로이드 발생, 그리고 잠재적으로 오염의 증가 가능성 (데이터 표시 되지 않음). 난소 피질을 배양하는.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
이 연구는 ASC에 국립 식품 농업 연구소에 의해 지원 되었다 2013-67015-20965 ASC에, 건강 경쟁 보조금에 대 한 네브래스카 식품 대학. 미국 농무부 보조금 NEB26-202/W3112 가입 #1011127 ASC, 해치-NEB ANHL 가입 #1002234 ASC에. 양적 생명 과학 이니셔티브 여름 박사 후 학자 지원 – CMS에 대한 여름 자금에 대한 COVID-19 상.
저자는 로버트 쿠시먼 박사, 미국 육류 동물 연구 센터, 클레이 센터, NE박사에게 감사를 표하고 싶습니다 이전 출판물에서 난소를 제공 한 그에게 감사, 이는 다음이 기술을 검증하는 개념의 증거로 현재 논문에 사용된.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| #11 스케이프 블레이드 | 스완-모튼 | 303 | Scaple Blade |
| #21 Scapel Blade | 스완-모튼 | 307 | Scaple Blade |
| 500mL 병 상단 필터 | Corning | 430514 | 병 상단 필터 0.22 µ 매체 필터링을 위한 m pore |
| AbsoluteIDQ Sterol17 Assay | Biocrates | Sterol17 Kit | 샘플은 Biocrates로 보내지고 스테로이드 패널이 실행되어 결과가 반환됩니다 |
| 안드로스테네디온을 결정하기 위한 안 | 드로스테네디온 이중 항체 RIA 키트 | MPBio | 7109202 |
| DIA 출처 | KIP0451 | 배양 배지에서 안드로스테네디온을 측정하기 위한 RIA | |
| 소 사이토카인 어레이 Q3 | RayBiotech | QAB-CYT-3-1 | 배양 배지 세포에서 사이토카인을 결정하기 위한 사이토카인 키트 |
| Sens, Software Standard 1.3 | Olympus | 7790 | 이미징 소프트웨어 |
| 인슐린-트랜스페린-셀레늄-X | Gibco ThermoFisher Scientific | 5150056 | 배양 배지 |
| 에 추가Leibovitz의 L-15 Medium | Gibco ThermoFisher Scientific | 4130039 | 깨끗한 벤치에서 티슈 세척에 사용되며, 생물 안전 캡니엣에서 사용됩니다. |
| 현미경 | 조직 배양 조각을 이미징하는 데 사용되는 | Olympus | SZX16 |
| 현미경 카메라 | Olympus | DP71 | 현미경 카메라는 조직 배양 조각을 이미징하는 데 사용됩니다 |
| 밀리셀 세포 배양 인서트 0.4µ m, 12,mm 직경 | Millipore Sigma | PICM01250 | 조직이 매체에 잠기지 않고 매체에 닿을 수 있도록 하는 인서트 |
| Multiwell 24 well plate | Falcon | 353047 | Plates meduim, inserts 및 조직을 고정하는 데 사용되는 |
| 페트리 접시 60 x 15 mm | Falcon | 351007 | 배양 전 세척 단계에 사용되는 페트리 접시 |
| 인산염 완충 식염수(PBS 1X) | Corning | 21-040- 조직 | 세척에 사용되는 |
| SAS 버전 9.3 | SAS Institute | 9.3 TS1M2 | 통계 분석 소프트웨어 |
| Thomas Stadie-Riggs 조직 슬라이서 | Thomas Scientific | 6727C10 | 신선한 조직의 얇고 균일한 절편의 준비를 위한 조직 슬라이 |
| 서 Waymouth MB 752/1 Medium | Sigma-Aldrich | W1625 | 조직 배양에 사용되는 배지 |
참고문헌
- Braw-Tal, R., Yossefi, S. Studies in vivo and in vitro on the initiation of follicle growth in the bovine ovary. Journal of Reproduction and Fertility. 109, 165-171 (1997).
- Nilsson anEdson, M. A., Nagaraja, A. K., Matzuk, M. M. The mammalian ovary from gen....
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재인쇄 및 허가
