جزيء واحد RNA مضان في التهجين الموقعي (smFISH) هو وسيلة لتحديد مستويات بدقة وتوطين الحمض النووي الريبي محددة على مستوى الخلية الواحدة. هنا، نقوم بالإبلاغ عن بروتوكولات المختبر المعتمدة لدينا لمعالجة مقاعد البدلاء الرطبة والتصوير وتحليل الصور للقياس الكمي لخلايا واحدة من RNAs محددة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تحليل خلية واحدة من الأليل النشطة نسخيا بواسطة جزيء واحد FISH
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
النسخ الجيني هو عملية أساسية في بيولوجيا الخلايا، ويسمح للخلايا بتفسير الإشارات الداخلية والخارجية والاستجابة لها. تفتقر الطرق السكانية السائبة التقليدية (البقعة الشمالية، PCR، وRNAseq) التي تقيس مستويات الحمض النووي الريبي إلى القدرة على توفير معلومات عن الاختلاف بين الخلايا في الاستجابات. خلية واحدة دقيقة والتصور allelic والتحديد الكمي ممكن عن طريق جزيء واحد RNA مضان في التهجين الموقعي (smFISH). يتم تنفيذ RNA-FISH عن طريق تهجين الحمض النووي الريبي المستهدف مع مسابير أوليغونوكليوتيد المسماة. ويمكن تصوير هذه الأساليب في طرائق متوسطة/عالية الإنتاجية، ومن خلال خطوط أنابيب تحليل الصور، توفر بيانات كمية عن كل من الرنانات الناضجة والناضجة، وكلها على مستوى الخلية الواحدة. وقد تم تحسين التثبيت، permeabilization، التهجين وخطوات التصوير في المختبر على مدى سنوات عديدة باستخدام نظام النموذج الموصوف هنا، مما يؤدي إلى تحليل خلية واحدة ناجحة وقوية من وسم سمك البحر المتوسط. الهدف الرئيسي مع إعداد العينات ومعالجتها هو إنتاج صور عالية الجودة تتميز بنسبة عالية من الإشارة إلى الضوضاء للحد من الإيجابيات الكاذبة وتوفير بيانات أكثر دقة. هنا، نقدم بروتوكول يصف خط الأنابيب من إعداد العينات إلى تحليل البيانات بالتزامن مع الاقتراحات وخطوات التحسين لتكييفها مع عينات محددة.
المقدمة
النسخ الجيني والترجمة هما عمليتان رئيسيتان تشاركان في العقيدة المركزية لعلم الأحياء ، من تسلسل الحمض النووي إلى الحمض النووي الريبي إلى البروتين1. في هذه الدراسة، ونحن نركز على إنتاج الحمض النووي الريبي رسول (مرنا) أثناء النسخ. جزيء الحمض النووي الريبي الوليدة يتضمن كل من introns غير الترميز وإكسونات الترميز. Introns هي مقسمة نسخا قبل أن ينتقل إلى الخلايا مرنا للترجمة على ريبوسوم2,3.
تقليديا، يتم إجراء قياس الحمض النووي الريبي في مجموعات كبيرة من الخلايا (مئات إلى ملايين) مع المقايسات الكلاسيكية مثل RT-qPCR أو النشاف الشمالي. في حين قوية جدا، وهذه الأساليب مح....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
لضمان أفضل النتائج، يتطلب جزء المعمل الرطب من هذا البروتوكول احتياطات قياسية خالية من RNase في جميع الخطوات. على سبيل المثال، يتم تشجيع استخدام نصائح ماصة المصفاة والأوعية العقيمة والمخازن المؤقتة الخالية من RNase. كما يقترح استخدام مثبطات RNase مثل مجمعات فاناديل ريبونوكليوسيد، وخاصة بالنسبة لرناس منخفضة الوفرة المستهدفة.
1. ثقافة الخلية والإعداد التجريبي
- الحفاظ على الخلايا السرطانية الثدي MCF-7 (ATCC #HTB-22) في قارورة زراعة الأنسجة T75 مع فينول الأحمر مجانا (مطلوب فقط لتجارب التحفيز الهرموني) دولبيكو تعديل النسر المتوسطة (DMEM) تكملها مع 10٪ مصل البقر الجنيني (FBS)، 2 MM L-الجلوتامين، 1 nM بيروفات الصوديوم، 50 ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
لتحليل الاستجابات الهرمونية عبر smFISH ، على سبيل المثال ، اخترنا نموذج مستقبلات الإستروجين (ER) المستخدم في فحوصات الإنتاجية العالية لتحديد وجود مواد كيميائية معطلة للغدد الصماء في الكوارث البيئية في سياق المشاركة في برنامج أبحاث NIEHS Superfund7. في هذه التجربة، عولجت خلايا سرطان الثدي MCF-7 الملتصقة بناهض الرضة 17β-استراديول (E2، 10 nM) أو السيارة (DMSO) لمدة 24 ساعة. مجموعات التحقيق المنفصلة أطيافا ضد GREB1 intronic (Atto 647N، الأحمر في الشكل 1)و exonic (Quasar 5.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
تستند منهجية smFISH الموصوفة إلى البروتوكولات المنشورة سابقا7و12و14. في هذا البروتوكول، نشرح الخطوات الحرجة التي تم تحسينها من المختبر الرطب (بما في ذلك كثافة البذر، ووقت التثبيت، والبيرمابيلية، وتركيز المسبار)، إلى التصوير وتحليل الصور، وتوفير خط أنابيب تجريبي كامل للمختبرات المهتمة بإجراء تحليل خلية واحدة للنسخ الجيني.
لتسهيل تحليل الخلية الواحدة، من المهم أن تكون الخلايا تحت السائل ولا تتداخل بحيث .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.
شكر وتقدير
يتم تمويل MAM و FS و MGM من قبل NIEHS (المشروع 4 ، P42ES027704 ، PI ، Rusyn). يتم دعم MAM و FS و RMM و MGM و PKS من قبل مركز دول مجلس التعاون الخليجي الممول من CPRIT للتنظير المتقدم والمعلوماتية بالصور (RP170719). كما يدعم التصوير من قبل الأساسية المجهر المتكاملة في كلية بايلور للطب بتمويل من المعاهد القومية للصحة (DK56338، وCA125123)، CPRIT (RP150578)، ومركز دان ل. دنكان الشامل للسرطان، واتحاد جون س. دان ساحل الخليج لعلم الجينوم الكيميائي.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 17 وبيتا ؛ استراديول | سيجما-ألدريتش | E2257 | رقم CAS 50-28-2 |
| Ambion SSC (20X) عازلة ، خال من Rnase | ThermoFisher Scientific | AM9770 | |
| Corning DMEM مع L-Glutamine و 4.5 جم / لتر جلوكوز | فيشر Scientific | MT10017CV | المصنعة بواسطة Invitrogen |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D8417 | بدون كبريتات بيروفات الصوديوم |
| ديكستران ، محلول معقم بنسبة 50٪ | سيجما ألدريتش | 3730-100 مل | |
| فولبيكو فوسفات مخزن ملحي Ca ++ / MG ++ | Corning | 21030CV | صنع بواسطة Calbiochem |
| Ethanol ، 200 دليل (100٪) | فيشر Scientific | 07-678-005 | |
| Falcon 24-Well Clear Flat bottom معالج TC لوحة ثقافة الخلايا متعددة الآبار | Corning | 353047 | المصنعة من قبل Decon Laboratories |
| Fetal مصل الأبقار (FBS) ، 500 مل | فيشر ساينتفيك | 50-753-2978 | المصنعة بواسطة Gemini Bio Products |
| GE Healthcare DeltaVision LIVE مجهر إزالة الالتفاف عالي الدقة | GE Healthcare Hyclone | ||
| Water ، بيولوجيا جزيئية درجة | فيشر SH3053802 | ||
| الغمر 1.516 | GE Healthcare Life | Sciences 29162940 | المصنعة بواسطة GE محلول |
| L-glutamine | Fisher Scientific | MT25005Cl | تم تصنيعها بواسطة خلايا Corning |
| MCF-7 | ATCC | HTB-22 | |
| Molecular Grade Formamide | Promega | PAH5051 | |
| Olympus 60x / 1.42 NA Objective | Olympus | ||
| Parafilm | Bemis Company، Inc. | 52858-076 | تم توزيعه بواسطة VWR |
| Paraformaldehyde ، محلول 16٪ ، | علوم المجهر الإلكتروني | EM 15710 | |
| حل Penicilin-Streptomycin | Fisher Scientific | MT3001Cl | المصنعة بواسطة Corning |
| Ribonucleoside Vanadyl Complex | VWR | 101229-716 | المصنعة من قبل New England Biosciences |
| RNase Away | Ambion | 9780 | |
| بيروفات الصوديوم ، 100 ملم | فيشر سيانتيفيك | 11-360-070 | المصنعة من قبل جيبكو |
| ثيرمو ساينتيفيك أغطية زجاجية ، # 1.5 | فيشر سيانتيفيك | 12-545-81P | |
| تريتون X-100 ، 100 مل | فيشر ساينتفيك | BP151-100 | المصنعة بواسطة فيشر بيوالكواشف الحيوية |
| محلول تريبسين-EDTA 0.25٪ | سيجما-ألدريتش | T4049-500ML | |
| Vectashield تركيب مضاد للبهتان متوسط 10 مل | NC9265087 | فيشر Scientific | المصنعة من قبل Vector Laboratories |
المراجع
- Russell, P. J. Gene Expression: Transcription. iGenetics: A Mendelian Approach. , Pearson Education, Inc. 331-352 (2006).
- Darnell, J. E. Variety in the level of gene control in eukaryotic cells. Nature. 297, 365-371 (1982).
- Köhler, A., Hurt, E.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
