DNA 부가물과의 복제 포크 충돌은 이중 가닥 절단을 유발할 수 있지만 리플리솜과 차단 병변 사이의 상호 작용에 대해서는 알려진 바가 적습니다. 우리는 이러한 만남을 시각화하고 반응 구성에 대한 결과를 특성화하기 위해 근접 결찰 분석을 사용했습니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
방법 논문
항원 태그가 붙은 차단 병변을 사용한 반응체 만남의 시각화
* These authors contributed equally
이 논문에서
정오 공지
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
요약
초록
뉴클레아제, 방사선 및 기타 DNA 차단기에 의해 유도된 이중 가닥 절단(DSB)에 대한 세포 반응에 대한 상당한 통찰력이 있습니다. 부분적으로, 이것은 휴식 부위의 식별을 위한 방법의 가용성과 해당 서열에서 DSB에 모집된 인자의 특성화를 반영합니다. 그러나 DSB는 직접 파손을 일으키지 않고 특정 서열 부위에서 반응하지 않는 화합물에 의해 형성된 DNA 부가물을 처리하는 동안 중간체로도 나타납니다. 결과적으로, 이들 제제의 대부분에 대해, 반응 인자 및 복구 단백질과의 결합 상호작용을 분석할 수 있는 기술은 알려져 있지 않다. 예를 들어, DNA 가닥 간 가교 (ICL)는 복제 포크 발생 후 중단을 유발할 수 있습니다. 암 화학 요법제로 널리 사용되는 약물에 의해 형성되었지만 복제 단백질과의 상호 작용을 모니터링하는 방법론은 없었습니다.
여기에서는 이러한 까다로운 부가물과의 포크 충돌에 대한 세포 반응을 따르기 위한 전략을 설명합니다. 우리는 스테로이드 항원을 살아있는 세포의 핵에서 광활성화 의존성 ICL을 형성하는 소랄렌에 연결했습니다. ICL은 항원 태그에 대한 면역형광으로 시각화되었습니다. 태그는 또한 두 항원의 밀접한 연관성을 보고하는 근접 결찰 분석(PLA)의 파트너가 될 수 있습니다. PLA는 태그가 부착된 ICL과 밀접하게 관련된 단백질과 그렇지 않은 단백질을 구별하기 위해 이용되었습니다. ICL과의 만남 후에 유지된 반응성 단백질을 정의하고 손실된 다른 단백질을 식별하는 것이 가능했습니다. 이 접근법은 면역학적으로 검출될 수 있는 모든 구조 또는 DNA 부가물에 적용할 수 있습니다.
서론
이중 가닥 절단에 대한 세포 반응은 특정 게놈 부위 1,2,3으로 절단을 지시하는 점점 더 강력한 방법의 연속으로 인해 잘 문서화되어 있습니다. 위치의 확실성은 부위에 축적되고 DNA 손상 반응(DDR)에 참여하는 단백질 및 기타 요인의 명확한 특성 분석을 가능하게 하여 파손을 복구하는 NHEJ(Non-Homologous End Conjoining) 및 HR(Homologous Recombination) 경로를 유도합니다. 물론, 방사선 및 특정 서열을 공격하지 않는 화학종과 같은 작용제에 의해 많은 단절이 발생한다4. 그러나, 이들을 위해, 태깅 및 현지화 5,6에 적합한 구조로 끝을 변환할 수 있는 절차가 있다. 면역글로불린 재배열(immunoglobulin rearrangement)과 같은 생물학적 과정에 의해서도 단절이 발생하며, 최근의 기술은 면역글로불린의 국소화를 허용하고 있다7. 그런 다음 응답 요인과 해당 사이트 간의 관계를....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
1. 세포 준비
- 1일차
- 35mm 유리 바닥 배양 접시를 세포 접착제 용액으로 전처리합니다.
- 플레이트 세포는 처리 하루 전에 전처리 된 접시에 담겨 있습니다. 세포는 실험 당일에 활발하게 분열하고 50-70 % 합류해야합니다.
참고: HeLa 세포는 10% 소 태아 혈청, 1x 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 Dulbecco Modified Eagle Medium DMEM과 함께 이 실험에 사용되었습니다. 부착 세포주에 대한 제한은 없습니다. 그러나 비부착성 세포는 PLA에 의한 분석 전에 슬라이드 상에 원심분리되고 고정되어야 합니다.
- 2일차
- 이전에 합성된 Dig-TMP의 동결 분취액을 1:1 EtOH:H 2O로 재현탁하여 Digoxigenin Trimethyl psoralen(Dig-TMP)의 저장 용액을 준비합니다. 용해된 Dig-TMP의 100x 희석액(in H2O)의 250nm에서 OD를 측정하여 농도를 결정합니다. Dig-TMP의 소멸 계수는 25,000입니다. 매번 사용하기 전에 250nm에서 OD를 측정하여 농도를 확인하고 스톡 농도를 계산합니다: Abs x 100 x 106/25,000 = 농도(μM). 일반적으로,....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
반응체 단백질을 가진 Dig-TMP의 PLA
Dig-TMP의 구조는 그림 1에 나와 있습니다. 트리메틸 소랄렌이 글리콜 링커를 통해 디곡시제닌에 접합된 합성의 세부 사항은 이전에 논의되었습니다17,21. 화합물과 함께 세포를 배양한 후 365nm 광(UVA)에 노출시키면 화합물이 광활성화되고 가교 반응이 촉진됩니다. 부가물의 90 % 이상이 ICL16입니다. Dig 태그는 핵 전체에 ICL의 존재를 나타내는 면역형광으로 시각화할 수 있습니다(그림 2). MCM2와 같은 반응체 단백질의 면역형광은 또한 핵 전체에 분포를 나타내며, 이 분포는 ICL의 도입에 의해 영향을 받지 않습니다. 이러한 결과는 DSB에 대한 DNA 손상 반응(DDR)에서 .......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
PLA는 매우 강력한 기술이지만 명확하고 재현 가능한 결과를 얻기 위해 해결해야 하는 기술적 문제가 있습니다. 항체는 높은 친화력과 특이성을 가져야 합니다. 또한 비특이적 배경 신호를 최대한 줄이는 것이 중요합니다. 우리는 막과 세포 파편이 배경에 기여한다는 것을 발견했으며 가능한 한 많이 제거했습니다. 고정하기 전에 완충액을 함유한 세제로 세척하고, 고정한 후 메탄올로 세척하면 비특이적 결합을 줄이는 데 도움이 됩니다. 주의할 점은 고정 전에 세제를 처리하면 세포가 박리될 수 있다는 것입니다. 우리는 CSK 처리 전에 플레이트를 세포 접착제로 처리하고 0.1% FA로 접두사를 붙이면 이 문제가 완화된다는 것을 발견했습니다.
또한 S 단계 특정 이벤트를 모니터링할 때 비 S 단계 셀을 식별하는 데 도움이 됩니다. 이는 PCNA 또는 NPAT24,25와 같은 세포 주기 마커를 .......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
이 연구는 미국 국립 노화 연구소 (National Institute on Aging, United States)의 NIH 교내 연구 프로그램 (Z01-AG000746-08)에 의해 부분적으로 지원되었습니다. J.H.는 중국 국립 자연 과학 재단 (21708007 및 31871365)의 지원을 받고 있습니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Alexa Fluor 568, 염소 항 토끼 IgG (H + L) 교차 흡착 된 2 차 항체 | Invitrogen | A-10011 | 1 in 1000 |
| 35mm 플레이트 (유리 1.5 커버 슬립 | 포함) MatTek | P35-1.5-14-C | 유리 바닥 마이크로 웰 접시 35mm 페트리 접시 마이크로 웰 |
| Alexa Fluor 488, 염소 안티 마우스 IgG (H + L) 교차 흡착 된 2 차 항체 | Invitrogen | A-10001 | 1 in 1000 |
| 소 혈청 알부민 (BSA) | SeraCare | 1900-0012 | 차단 용액, 시약은 4°C에서 보관해야 합니다. C |
| CDC45 항체 (토끼) | Abcam | ab126762 | 1 in 200 |
| 세포 접착제 | 생명 과학 | 354240 | 세포 TAK 솔루션 |
| 컨포칼 현미경 | Nikkon | Nikon TE2000 회전 디스크 현미경 | Volocity 소프트웨어 |
| Digoxigenin (Dig) 항체 (마우스) | Abcam | ab420 | 1 in 200 |
| Dig-TMP | Seidman Lab | ||
| Duolink 증폭 시약(5회;) | Sigma-Aldrich | DUO82010 | 시약은 -20°C에서 보관해야 합니다. C |
| Duolink 현장 검출 시약 | Sigma-Aldrich | DUO92007 | 시약은 -20°C에서 보관해야 합니다. C |
| Duolink in situ 올리고뉴클레오티드 PLA 프로브 MINUS | Sigma-Aldrich | DUO92004 | 안티 마우스 MINUS, 시약은 4°C에서 보관해야 합니다. C |
| Duolink in situ oligonucleotide PLA probe PLUS | Sigma-Aldrich | DUO92002 | anti-rabbit PLUS, 시약은 4°C에서 보관해야 합니다. C |
| Duolink in situ 세척 버퍼 A | Sigma-Aldrich | DUO82046 | Duolink 세척 버퍼, 시약은 4°C에서 보관해야 합니다. C |
| Duolink in situ 세척 버퍼 B | Sigma-Aldrich | DUO82048 | Duolink 세척 버퍼, 시약은 4°C에서 보관해야 합니다. C |
| 에피 형광 현미경 | Zeiss | Axiovert 200M 현미경 | Axio Vision 소프트웨어 패키지 장착 (Zeiss, 독일) |
| 포름 알데히드 16 % | Fisher Scientific | PI28906 | for fix |
| solution Goat serum | Thermo | 31873 | 차단 솔루션, 시약은 4 °C에 보관해야합니다. C |
| 이미지 분석 소프트웨어 | 오픈 소스 | Cell profiler | 는 단일 평면 이미지 분석을 위해 작동합니다 |
| 이미지 분석 소프트웨어 라이센스 필요 | Bitplane | Imaris | Cell Biology 모듈이 필요합니다. 이미지 스택(3D)에서 PLA 점/핵을 정량화하고 3D 재구성 |
| 리가아제(1 unit/μ l) | Sigma-Aldrich | DUO82029 | 시약은 -20°C에서 보관해야 합니다. C |
| 결찰 시약 (5×) | Sigma-Aldrich | DUO82009 | 시약은 -20°C에서 보관해야 합니다. C |
| MCM2 항체 (토끼) | Abcam | ab4461 | 1 in 200 |
| MCM5 항체 (rabbit monoclonal) | Abcam | Ab75975 | 1 in 1000 |
| 메탄올 | 연구소 ALLEY | A2076 | -20°deg; C 사용 전 |
| phosphoMCM2S108 항체 (토끼) | Abcam | ab109271 | 1 in 200 |
| 중합효소 (10 단위/μ l) | Sigma-Aldrich | DUO82030 | 시약은 -20°C에서 보관해야 합니다. C |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | P36935 | |
| PSF1 항체(토끼) | Abcam | ab181112 | 1 in 200 |
| RNAse A 100 mg/ml | Qiagen | 19101 | °C에 보관해야 합니다. C |
| 통계 분석 및 데이터 시각화 소프트웨어 | 오픈 소스 | R studio | ggplot2 패키지 도트 플롯 및 상자 플롯 생성을 위한 |
| 분석 및 데이터 시각화 소프트웨어 라이선스 필요 | Systat 소프트웨어 | Sigmaplot V13 | |
| TMP (trioxalen) | Sigma-Aldrich | T6137_1G | |
| TritonX-100 | Sigma-Aldrich | T8787_250ML | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416_100ML | |
| UV 박스 | 남부 뉴잉글랜드 자외선 | 단종 가능한 | |
| 교체 UV 테스트 챔버 | Opsytec | UV 테스트 챔버 BS-04 | |
| VE-821 | Selleckchem | S8007 | 최종 농도는 1µ입니다. 미디엄 |
참고문헌
- Rouet, P., Smih, F., Jasin, M. Introduction of double-strand breaks into the genome of mouse cells by expression of a rare-cutting endonuclease. Molecular and Cellular Biology. 14 (12), 8096-8106 (1994).
- Wright, D. A., et al.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
정오
Formal Correction: Erratum: Visualization of Replisome Encounters with an Antigen Tagged Blocking Lesion
Posted by JoVE Editors on 1/09/2023. Citeable Link.
An erratum was issued for: Visualization of Replisome Encounters with an Antigen Tagged Blocking Lesion.
The Authors section was updated from:
Jing Zhang*1
Jing Huang*2
Ryan C. James3
Julia Gichimu1
Manikandan Paramasivam4
Durga Pokharel5
Himabindu Gali6
Marina A. Bellani1
Michael M Seidman1
1Laboratory of Molecular Gerontology, National Institute on Aging, National Institutes of Health
2Institute of Chemical Biology and Nanomedicine, State Key Laboratory of Chemo/Biosensing and Chemometrics, College of Biology, Hunan University
3Department of Molecular Biology and Genetics, Cornell University
4Department of Cellular and Molecular Medicine, University of Copenhagen
5Horizon Discovery
6Boston University School of Medicine
* These authors contributed equally
to:
Jing Zhang*1
Jing Huang*2
Ishani Majumdar1
Ryan C. James3
Julia Gichimu1
Manikandan Paramasivam4
Durga Pokharel5
Himabindu Gali6
Marina A. Bellani1
Michael M Seidman1
1Laboratory of Molecular Gerontology, National Institute on Aging, National Institutes of Health
2Institute of Chemical Biology and Nanomedicine, State Key Laboratory of Chemo/Biosensing and Chemometrics, College of Biology, Hunan University
3Department of Molecular Biology and Genetics, Cornell University
4Department of Cellular and Molecular Medicine, University of Copenhagen
5Horizon Discovery
6Boston University School of Medicine
* These authors contributed equally
