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方法文章

Astyanax mexicanus 繁殖和产卵最适条件下的渐进式温度变化

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DOI：

10.3791/61708

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2021年2月14日

 ,  ,  , 
1Department of Biology, University of Maryland

本文内容

摘要

本文概述了用于诱导墨西哥盲鱼Astyanax mexicanus最大程度产卵的基本实验室条件和实验方案，该物种是发育与进化研究领域的一个新兴模式生物。

摘要

墨西哥四眼鱼（Astyanax mexicanus）是研究发育与进化生物学的一个新兴模式系统。该物种中存在具眼的表层形态（表层鱼）和无眼的洞穴形态（洞穴鱼），为探究形态与行为进化的潜在机制提供了独特机会。洞穴鱼在进化过程中获得了多种新的构造性特征和退化性特征。构造性变化包括味蕾和下颌的增加、侧线感觉器官的发达以及体脂含量的升高；退化性变化则包括眼睛的缺失或退化、黑色素色素的减少、群游行为的丧失、攻击性的降低以及睡眠时间的减少。为了通过实验手段深入研究这些变化，获得大量受精卵胚胎至关重要。自20世纪90年代在德克萨斯州和墨西哥采集到最初的A. mexicanus表层鱼和洞穴鱼以来，其后代已在Jeffery实验室中被定期诱导繁殖，每两个月可产生成批的胚胎。尽管繁殖过程受到食物丰度与质量、明暗周期和温度等因素调控，但我们发现，逐步变化的温度在诱导最大程度产卵方面起着关键作用。在一个繁殖周的前3天内，将水温从72 °F逐步升高至78 °F，可实现连续两到三天的高效产卵，获得数量最多且质量最高的胚胎；随后在产卵周的最后3天内，再将温度从78 °F逐步降低至72 °F。本视频所展示的流程详细说明了在实验室条件下，为实现温度梯度诱导产卵而在繁殖周前后所执行的操作步骤。

引言

硬骨鱼 Astyanax mexicanus 具有具眼的穴居表层鱼类（表层鱼）形态，以及多种不同的盲眼洞穴鱼类（洞穴鱼）形态1,2洞穴鱼在持续黑暗和食物受限的环境中进化，导致了新的建设性性状和退化性性状的出现3。建设性性状包括味蕾和下颌尺寸的增加、侧线感觉器官以及脂肪储备。退化性性状包括黑色素沉着、眼睛以及某些行为（如睡眠、群集行为和攻击性）的缺失或退化。一种该物种的属性 Astyanax 两种形态之间具有完全的生育能力，使得可利用数量性状位点（QTL）定位来确定与建构性进化和退行性进化相关的基因组区域4,5,6,7. A. mexicanus 提供了一个研究发育的有利体系，因为它可在实验室中被诱导频繁产卵。其胚胎 A. mexicanus 呈半透明状，略大于斑马鱼的卵，可大量产出，并在约8-12个月内发育为性成熟的成体。其产卵能力的高峰期约为5年。本方案描述了在实验室中进行相关操作所需的流程 A. mexicanus 在典型繁殖周期内，养殖设施的管理细节，包括鱼类系统的维护以及为实现最大产卵量而采取的温度控制方案。

A. mexicanus 是一种热带鱼类，栖息于石灰岩高原的河流（表型鱼）以及石灰岩洞穴中的水池（洞穴型鱼）8。石灰岩溶解后形成硬水，A. mexicanus 能在硬水中良好生长。适应硬水环境的鱼类可耐受一定范围的盐度条件，但通常在特定条件下繁殖9。产卵行为的诱导需多种因素共同作用。由于鱼类为变温动物，依赖外界环境维持体内稳态，其代谢对环境变化敏感，对胁迫因素反应更为迅速10。A. mexicanus 应在水流量、pH、电导率、渗透压、光照和水温等参数均严格调控的水生系统中进行培养。

在Jeffery实验室中，鱼类饲养于两个流水系统中：（1）“幼鱼系统”，用于性成熟前的年轻成鱼；（2）成鱼（或主）系统，用于性成熟的繁殖成鱼。“幼鱼系统”由8 L和15 L的水箱组成，供应流动水。该系统中的幼鱼和刚完成变态的幼体最初在较小（1–10 L）的水箱中由鱼苗培育而来，这些小水箱每周换水一次。鱼苗、仔鱼和幼鱼对食物高度依赖，必须每天投喂一次活饵（卤虫），以确保较高的存活率。来自“幼鱼系统”的年轻幼鱼在约1–1.5年后被转移至成鱼系统。初期投喂碾碎的薄片饲料，随着进一步生长，再转入常规的成鱼喂养方案。雌鱼的性成熟可通过腹部体积进行评估，性别鉴定方法已有描述11。在成鱼系统中，42 L水箱内的水每24小时自动更换3次。该系统通过目视检查以及探头自动监测温度、pH值和电导率，每日进行监控。系统最适pH值约为7.4，可维持在6.8–7.5之间；基础温度为72/73 °F；理想电导率范围为600–800 mS。自动读数显示在控制器屏幕上，同时通过分布于整个系统的流量计读取水压的目视检查结果。每周还需通过比色法检测温度，并测定pH值、氨和硝酸盐等水质参数，以独立核查水质。通过向系统中添加有益细菌（如Nutafin Cycle），将氨和硝酸盐水平维持在零或接近零的水平。室内光照由定时器控制，设定为每日14小时光照、10小时黑暗。除上述整体水质参数外，在繁殖周还需特别关注以下事项。

首要考虑因素是光周期，因为鱼类（即使是在实验室中的洞穴鱼）依赖光周期来调节其昼夜节律。昼夜节律可影响从繁殖、摄食到免疫系统健康等各个方面12,13，为获得最佳健康效益，光周期必须保持稳定。鱼类在流水系统中饲养，采用14小时光照与10小时黑暗的光周期。通常情况下，表型鱼在系统转为黑暗约一小时后开始产卵，若在此期间引入光照，可能会干扰甚至终止产卵过程。盲眼洞穴鱼的产卵行为受光照干扰较小。与表型鱼相比，洞穴鱼的产卵时间较晚，通常在系统转为黑暗后四至五小时才开始。

第二个考虑因素是营养。成年鱼类通常每天投喂一次七彩神仙鱼薄片饲料。在产卵前，鱼类需投喂富含蛋白质的饲料，并额外补充七彩神仙鱼薄片及其他食物：蛋黄薄片，偶尔添加活的加利福尼亚黑蠕虫（Lumbriculus variegatus），以弥补上一个产卵周期因产卵造成的蛋白质流失。在繁殖周期的一周内，鱼类每天投喂两次，分别在早晨和下午/傍晚进行。应避免每天仅投喂一次但单次投喂量过大的方式，因为这可能导致营养不良14。

第三个考虑因素是空间。空间需求基于成年个体的平均体重，以及行为学因素，例如鱼类是否具有群游行为或攻击性行为。养殖密度过高或过低均可能导致攻击行为加剧和持续性应激，使鱼类容易受到同缸同伴的伤害，并且不愿参与繁殖活动15。我们通常在每个42 L的水族箱中饲养10至20条鱼。

第四个考虑因素是温度。如上所述，鱼类是变温动物，依赖环境来维持体温。由于温度对代谢过程具有直接影响，温度变化可能引发鱼类行为的改变16。本繁殖程序包含为期两周的温度循环：第一周将温度升高至78 °F，第二周则维持在72 °F的恒定温度。在第一周（繁殖周）的每个晚上，将带有塑料边缘的繁殖网放置在水族箱底部。繁殖网可在成鱼与产出的卵之间形成屏障，防止卵被摄食。温度在当周中期之前每天升高2 °F，直至达到最高78 °F，并在本周前2至3个傍晚根据光照周期诱导产卵。随后在当周剩余的几天内，温度以每天降低2 °F的幅度逐步降至72 °F，并在此后维持基础温度，直至下一轮繁殖周开始。通常每月诱导繁殖不超过两次，以保证鱼类有足够的恢复时间。

总体而言，该方法可实现大量产卵 在更长的时间内获得大量最优质胚胎。

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方案

本实验程序已获得马里兰大学帕克分校机构动物照护指南的批准（当前批准编号：IACUC 469 #R-NOV-18-59；项目编号：1241065-1）。

繁殖周与非繁殖周的鱼类饲养及水族箱维护时间表，包含每日任务和温度设置。
图1. 繁殖周与非繁殖周的维护日历。 请点击此处查看此图的放大版本。

1. 周一

  1. 在上午9-10点，进行水质检测及以下步骤1.1.1-4。
    1. 使用温度计记录房间、水箱和储水罐的温度。
    2. 使用比色法检测试剂盒记录氨、亚硝酸盐和硝酸盐的浓度。
    3. 从监测系统以及比色法检测试剂盒中记录pH值。
    4. 从大瓶储液器监测仪和主系统监测仪中记录电导率。
  2. 从上午10点开始，喂食所有鱼类。
    1. 使用Tetra牌鱼粮薄片喂食成鱼系统中的所有鱼类；对于饲养幼鱼的水箱，需先将薄片碾碎。每箱投喂量以鱼群可在3-5分钟内完全摄食完毕为宜，约为“一指捏量”。
  3. 检查用于培养胚胎的孵化箱，必要时更换水。
    1. 打开胚胎孵化箱，检查所有储水槽的水位。若水位偏低，则补充系统用水。检查孵化箱的温度设置，胚胎培养温度应维持在73-77 °F（23-25 °C）。
  4. 清洁活体饵料。
    1. 清洁黑虫时，从活饵冰箱中取出未加盖的盛有黑虫培养物的特百惠容器，将虫团上方多余的水倒入水槽。使用蒸馏水反复悬浮并冲洗黑虫，直至倒出的水变清澈为止。
    2. 加入足量清洁水，使虫团约有一半被浸没。将剩余黑虫放回活饵冰箱中，保持未加盖状态。
  5. 喂食鱼类。
    1. 在首次喂食至少30分钟后，对需要促进繁殖的水箱中的鱼类投喂蛋黄薄片、黑虫或两者同时投喂。每箱添加约“一指捏量”的蛋黄薄片；黑虫则根据水箱中每条鱼可摄食5-10条的量，加入足够的虫团。
  6. 在上午10点至下午1点之间，将水温设定为74 °F。
  7. 根据需要刷洗繁殖水箱，并安置繁殖网。
  8. 在最后一次喂食后至少一小时再进行水箱清洁并放置繁殖网。在放置繁殖网前，需先清洁所有相关水箱。设置繁殖网时应小心操作，避免影响水箱的供气系统。

2. 周二

  1. 收集胚胎并清洗所有繁殖网。
    1. 上午9-10点，从成鱼系统水箱底部取出繁殖网。使用连接在大瓶上的软管将胚胎轻轻冲洗至手持网中，然后将手持网倒置入盛有清洁系统水的培养皿中，使胚胎排出。
    2. 收集并清洗每组胚胎，然后放入盛有含0.00003%亚甲蓝（蓝色水）的洁净系统水的指形管中。若单个水箱产生的胚胎数量特别多，应将其分装至多个指形管中。每个指形管中活胚胎的浓度应约为每200 mL蓝色水含100个胚胎。
    3. 通过显微镜下观察胚胎发育阶段，并结合已发表的参考标准来估算受精时间 A. mexicanus 发育时间表17.
    4. 频繁观察装有胚胎的培养皿，使用巴斯德吸管移除死亡或畸形的胚胎以及残渣（如未食用的食物或粪便）。频繁更换培养皿中的蓝色水。
    5. 将培养皿放入培养箱中孵育5-7天。此时卵黄已耗尽，需投喂活体丰年虾以支持进一步发育。
  2. 采集产卵数据。
    1. 对于每一个产出胚胎的培养皿，记录以下信息。
      1. 记录日期和水箱编号。
      2. 记录掉落的胚胎大致数量（图2):
        高（500以上）
        中等（200-500）
        低(<200)
      3. 记录丢弃胚胎的质量（图2):
        高（>75% 存活
        中等（25-50% 存活）
        低（<25% 存活
      4. 通过查阅相关资料估算最初的产卵时间 Astyanax mexicanus 分期表17.
      5. 记录鱼类产卵时系统设定的温度。
  3. 喂食所有鱼类。
  4. 将水温设定为 76 °F.
  5. 准备活体饲料。
  6. 喂养鱼 #2。
  7. 从水箱中舀出多余的食物和碎屑，并在重置网具前进行刷洗。

3. 周三

  1. 重复步骤 2.1–2.2。收集胚胎并清洗所有繁殖网。
  2. 照常记录产卵数据。
  3. 照常进行水质检测。
  4. 喂食所有鱼类。
  5. 将水温设定为 78 °F。
  6. 准备活体饵料。
  7. 检查孵化箱中的胚胎。
    1. 清洗并更换指形管中胚胎的水，这些胚胎最终将用于补充普通成年种群。使用亚甲蓝处理过的系统水。
  8. 再次喂食鱼类。
  9. 根据需要清洁水箱并重置繁殖网。

4. 周四

  1. 重复步骤 2.1–2.2。收集胚胎，并清洗和存放繁殖网。
  2. 照常记录产卵数据。
  3. 将水温设置为 76°F。
  4. 清洁活体饵料。
  5. 清洁所有单独的养殖缸。
  6. 检查孵化箱中的胚胎。
  7. 喂养鱼类 #2。

5. 星期五

  1. 喂食所有鱼类。
  2. 将水温设置为 74 °F。
  3. 清洁活体饵料。
  4. 检查孵化箱中的胚胎。

6. 星期六

  1. 喂鱼。

7. 星期日

  1. 喂鱼。

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结果

我们通常繁殖和培育来自墨西哥圣路易斯波托西州纳西米恩托-德尔里奥乔伊（Rio Choy surface fish）的地表鱼类后代，以及来自德克萨斯州巴尔莫雷亚州立公园圣所罗门泉（Texas surface fish）的地表鱼类后代；洞穴鱼类则源自墨西哥塔毛利帕斯州的埃尔帕琼洞穴（Pachón cave fish）、墨西哥圣路易斯波托西州的洛斯萨比诺斯洞穴（Los Sabinos cave fish）和蒂纳哈洞穴（Tinaja cave fish）。

在繁殖周期的一周内，需对多个水箱的数据进行收集。观察每个水箱中产出的胚胎数量和质量。数量分为高、中、低三个等级：若产出的胚胎数量超过500，则记录为“高”；若数量在200至500之间，则记录为“中”；若数量少于200，则记录为“低”。质量同样分为高、中、低三个等级：若培养皿中存活的胚胎比例超过75%，则记录为“高”；若存活比例在25%至75%之间，则记录为“中”；若存活比例低于25%，则记录为“低”。数量和质量等级随后被赋予数值，其中“高”对应3，“中”对应2，“低”对应1。若某次繁殖未产出胚胎，或产出的胚胎均无存活，则赋值为0。

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讨论

Astyanax mexicanus 是一种新型的生物学模型，繁殖频繁且易于在实验室中培育1,2。由于我们关注的是A. mexicanus洞穴鱼进化变化背后的发育机制，因此胚胎的获取与使用对实现我们的研究目标至关重要。饲养成鱼的主要目的是为了获得用于发育实验的胚胎和幼鱼，并用于补充成体繁殖种群。在某些情况下，成鱼也可用于生理学、行为学或遗传学实验。遗传学实验需要配对交配或体外受精18。在温度诱导的繁殖周期中，可将表现出产卵行为的个体19从水族箱中取出，用于体外受精的杂交实验。

为了最大限度地提高用于研究的胚胎质量和数量，在繁殖周之前需要注意一些操作细节。操作鱼缸中的鱼类时，应仅使用指定的手持网具，每次使用后需将网具浸入网具浸泡液中，并用热水冲洗，以防止不同鱼缸之间的交叉污染。仔细清洗和消毒所有用于鱼类护理的器械。在将繁殖网放回鱼缸之前，...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢 David Martasian、Diedre Heyser、Amy Parkhurst、Craig Foote 和 Mandy Ng 为 Jeffery 实验室的 A. mexicanus 培养设施所做出的宝贵贡献。Jeffery 实验室的研究目前由美国国立卫生研究院（NIH）基金项目 EY024941 资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
黑涡虫Eastern Aquatics, Lancaster, PA无
繁殖网定制
丰年虾卵AquaCave Lake Forest, IL.无
比色测试试剂盒PetcoSKU:11916API 淡水 pH 测试试剂盒
蛋黄片Pentair, Minneapolis, MN无
指形管Carolina Biological Supply741004培养皿，4.5 英寸，250 mL
手持网任意宠物商店
胚胎培养箱Fisher Scientific51-029-321HPM405 L
Instant Ocean 海盐Spectrum Brands, Blacksburg, VA无
亚甲基蓝Sigma-Aldrich, St. Louis, MOM9140
巴斯德移液管Fisher Scientific13-678-205.75 英寸
网具浸泡液任意宠物商店
Nutrafin CycleAmazon无细菌促进剂
活体饲料冷藏冰箱任意来源
体视显微镜任意来源
温度计任意来源
Tetra 热带薄片饲料Spectrum Brands, Blacksburg, VA无

参考文献

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