Method Article

שילוב של הכלאה פלואורסצנטית באתרו עם אימונוהיסטוכימיה פלואורסצנטית על חלקי מוח טריים של עכברים קפואים או קבועים

DOI:

10.3791/61709

⸱

June 25th, 2021

 ,  , 
1Department of Pharmacology, School of Medical Sciences, University of New South Wales

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר שיטה לשילוב הכלאה פלואורסצנטית באתרו (FISH) ואימונוהיסטוכימיה פלואורסצנטית (IHC) באזורי מוח עכבר טריים קפואים וקבועים, במטרה להשיג FISH רב-תוויות ואות IHC פלואורסצנטי. IHC התמקד בחלבונים ציטופלזמיים וחלבונים המחוברים לממברנה.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הכלאה פלואורסצנטית באתרו (באנגלית: Fluorescent in situ hybridization, בקיצור FISH) היא טכניקה מולקולרית המזהה נוכחות והתפלגות מרחבית של תעתיקי רנ"א ספציפיים בתוך תאים. פנוטיפ נוירוכימי של נוירונים המזוהים פונקציונלית דורש בדרך כלל תיוג מקביל עם נוגדנים מרובים (חלבון מטרה) באמצעות אימונוהיסטוכימיה (IHC) ואופטימיזציה של הכלאה באתרו (RNA ממוקד), במקביל. ניתן להשיג "חתימה נוירוכימית" כדי לאפיין נוירונים מסוימים, אולם גורמים מסובכים כוללים את הצורך לאמת מטרות FISH ו-IHC לפני שילוב השיטות, והמספר המוגבל של רנ"א וחלבונים שניתן לכוון בו זמנית באותו מקטע רקמה.

כאן אנו מתארים פרוטוקול, המשתמש הן בתכשירים טריים קפואים והן בתכשירי מוח קבועים של עכברים, אשר מזהה מספר mRNA וחלבונים באותו אזור במוח באמצעות RNAscope FISH ואחריו פלואורסצנטיות immunostaining, בהתאמה. אנו משתמשים בשיטה המשולבת כדי לתאר את דפוס הביטוי של mRNA בשפע נמוך (למשל, קולטן גלנין 1) ו-mRNA בשפע גבוה (למשל, טרנספורטר גליצין 2), בגרעיני גזע המוח המזוהים אימונוהיסטוכימית.

שיקולים מרכזיים לסימון חלבונים במורד הזרם של בדיקת FISH מתרחבים מעבר להכנת רקמות ואופטימיזציה של תיוג בדיקת FISH. לדוגמה, מצאנו כי קשירת נוגדנים וספציפיות התיוג יכולים להיות מושפעים לרעה על ידי שלב פרוטאז בתוך בדיקת FISH. פרוטאזות מזרזות פיצול הידרוליטי של קשרים פפטידיים, ומקלות על כניסת גשושיות FISH לתאים, אולם הן עשויות גם לעכל את החלבון הממוקד על ידי בדיקת IHC שלאחר מכן, ולייצר קשירת מטרה. המיקום התת-תאי של חלבון המטרה הוא גורם נוסף התורם להצלחת IHC לאחר בדיקת FISH. ראינו שספציפיות IHC נשמרת כאשר חלבון המטרה קשור לממברנה, בעוד שהתמקדות IHC בחלבון ציטופלזמי דרשה פתרון בעיות נרחב. לבסוף, מצאנו שהטיפול ברקמה קפואה קבועה המותקנת במגלשה מאתגר יותר מרקמה קפואה טרייה, אולם איכות IHC הייתה בסך הכל טובה יותר עם רקמה קפואה קבועה, בשילוב עם RNAscope.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חלבונים ו-mRNA המגדירים באופן נוירוכימי תת-אוכלוסיות של תאי עצב מזוהים בדרך כלל עם שילוב של אימונוהיסטוכימיה (IHC) ו/או הכלאה באתרו (ISH), בהתאמה. שילוב ISH עם טכניקות IHC מאפשר אפיון של דפוסי קולוקליזציה ייחודיים לנוירונים פונקציונליים (קידוד נוירוכימי) על ידי מקסום יכולת התיוג המרובה.

שיטות ISH פלואורסצנטיות (FISH), כולל RNAscope, הן בעלות רגישות וספציפיות גבוהות יותר בהשוואה לשיטות גילוי RNA מוקדמות יותר כגון ISH רדיואקטיבי ו- ISH כרומוגני לא רדיואקטיבי. FISH מאפשר הדמיה של תעתיקי mRNA בודדים ככתמים מוכתמים מנוקבים1. יתר על כן, בדיקת RNAscope מאפשרת לסמן מספר גדל יותר של מטרות RNA בכל פעם, באמצעות תגי פלו....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

סיכום של שלבי קדם-עיבוד רקמות ניתן למצוא באיור 1. כל ההליכים בוצעו בהתאם לוועדת הטיפול והאתיקה בבעלי חיים של אוניברסיטת ניו סאות 'ויילס בהתאם להנחיות לשימוש וטיפול בבעלי חיים למטרות מדעיות (המועצה הלאומית לבריאות ומחקר רפואי באוסטרליה).

1. הכנת דגימה של רקמת מוח קפואה טרייה

  1. זילוח Transcardial
    1. הכינו חיץ פוספט 0.1 M (PB) 0.1 M (2500 U/L), pH 7.5. הפוך קרח יבש אתנול slurry על ידי ערבוב קרח יבש עם אתנול. זו תהיה טמפרטורה של כ -72 מעלות צלזיוס ותשמש להקפאה מיידית של הרקמה שנקטפה.
    2. המתת חסד של עכברים בוגרים C57BL/6 ו- Phox2b-GFP11 (מזהה מסד נתונים של גנום עכבר MGI:57....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מתארים שיטה לשילוב FISH מרובה עם IHC פלואורסצנטי כדי למקם ביטוי mRNA עבור GalR1 ו- GlyT2 באמצעות רקמות קבועות קפואות טריות ופרפורמלדהיד בהתאמה ב- NTS של העכבר. צנרת של תהליכי עיבוד הרקמות, FISH ו-IHC המתוארים בשיטות מוצגת באיור 1 ובאיור 2. טבלה 1 מספקת סיכום של בדיקת FISH ושילובי נוגדנים המשמשים בכל איור.

בדיקות בקרה נבדקות באופן שגרתי במקביל לבדיקת המטרה, כדי להבטיח את שלמות זרימת העבודה ולאשר את איכות הדגימ.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במדעי המוח, FISH ו-IHC משמשים באופן שגרתי לחקר הארגון המרחבי והמשמעות התפקודית של mRNA או חלבונים בתוך תת-אוכלוסיות עצביות. הפרוטוקול המתואר במחקר זה משפר את היכולת לזיהוי סימולטני של mRNA וחלבונים במקטעי מוח. בדיקת FISH-IHC המשולבת שלנו אפשרה זיהוי פנוטיפי של תת-אוכלוסיות עצביות מובחנות ב-NTS הן בתכשירים טריים קפואים והן בתכשירים קבועים במוח. FISH-IHC בתכשירי רקמות קפואות קבועות הניבו תוצאות IHC אמינות. לדוגמה, מולטיפלקס FISH עבור mRNA בשפע נמוך וגבוה (GalR1 ו-GlyT2 בהתאמה) ו-IHC (המכוון לטירוזין הידרוקסילאז) גילו כי Ga.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו מומנה על ידי מענק פרויקט דיסקברי של מועצת המחקר האוסטרלית DP180101890 ומענק פרויקט קרן המחקר הרפואי רבקה ל. קופר PG2018110

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
ANIMALS
C57BL/6 עכברAustralian BioResources, Moss ValeMGI: 2159769
Phox2b-eGFPAustralian BioResources, Moss ValeMGI: 5776545
REAGENTS
CyanoacrylateLoctite
אתילן גליקולסיגמא-אולדריץ'324558
הפרין-נתרןקליפורד האלאם 1070760התייעץ עם ספק וטרינרי מקומי או בית מרקחת.
Lethabarb (נתרן פנטברביטול) הזרקת המתת חסדVirbac (אוסטרליה) Pty LtdN/Aהתייעץ עם וטרינר לגבי תקנות התרופות המקומיות לגבי נתרן פנטברביטול
אבקת אגרוז בדרגה מולקולריתSigma Aldrich5077
OCT Compound, 118mLScigen Ltd4586
Paraformaldehyde, פריל, 95%סיגמא-אולדריץ'441244-1KG
פוליוויניל פירולידון, משקל מול ממוצע 40,000  (PVP-40)Sigma-AldrichPVP40
ProLong Gold Antifade MountantInvitrogenP36930עם או בלי DAPI
RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit (עד יכולת 3-plex)Advanced Cell Diagnostics, Inc. (ACD Bio)ADV320850כולל 50x מאגר כביסה ופרוטאז III
RNase AwayThermo-Fisher Scientific7003
Tris (הידרוקסימתיל)aminomethaneSigma-Aldrich252859
Tween-20, לביולוגיה מולקולריתSigma-AldrichP9416
EQUIPMENT
Benchtop incubatorThermoline Scientific Micro Incubatorדגם: TEI-13G
Brain Matrix, עכבר, 30 גרם מבוגר, Coronal, 1mmTed Pella15050
CryostatLeicaCM1950
מחט ציור (מד 23 אינץ')BD0288U07
מעבדות וקטורעט מחסום הידרופוביH-4000
Kimtech Science Kimwipes מגבוני משימות עדיניםקימברלי קלארק מקצועי34120
אולימפוס BX51אולימפוסBX-51
משאבהפריסטלטיתסדרת Coleparmer MasterflexL/S 
מצלמה דיגיטלית Retiga 2000RQImagingRET-2000R-F-CLRמצלמה צבעונית
SuperFrost Plus זכוכית שקופיות (לבן)Thermo-Fisher Scientific4951PLUS4
מיקרוטום רוטט (Vibratome)LeicaVT1200S
Whatman נייר סינון איכותי, דרגה 1, קוטר 110 מ"מMerckWHA1001110
<חזק> תוכנות
CorelDRAW Corel Corporationגרסה 7
FIJI (הפצת ImageJ)קוד פתוח/רישיון ציבורי כללי של GNU (GPL)N/AImageJ 2.x: Rueden, C. T.; שינדלין, ג'יי & Hiner, M. C. et al. (2017), "ImageJ2: ImageJ לדור הבא של נתוני תמונה מדעיים", BMC Bioinformatics 18:529, PMID 29187165, doi:10.1186/s12859-017-1934-z    ופיג'י: שינדלין, ג'יי; ארגנדה-קאררס, א. & Frise, E. et al. (2012), "פיג'י: פלטפורמת קוד פתוח לניתוח תמונות ביולוגיות", Nature methods 9(7): 676-682, PMID 22743772, doi:10.1038/nmeth.2019 
<נוגדנים חזקים>ראשוניים
נוגדן אנטי-טירוזין הידרוקסילאזMillipore SigmaAB1542פוליקלונל כבשים (דילול 1:1000), RRID: נוגדן
AB_90755 אנטי-טירוזין הידרוקסילאז, שיבוט LNC1Millipore SigmaMAB318חד-שבטי עכבר (דילול 1:1000), RRID: נוגדן
AB_2201528 אנטי-שלפוחית אצטילכולין טרנספורטר (VAchT)Sigma-AldrichABN100Goat polyclonal (דילול 1:1000), RRID: AB_2630394
GFP נוגדןNovus BiologicalsNB600-308ארנב פוליקלונלי (דילול 1:1000), RRID: נוגדן AB_10003058
Phox2b (B-11)Santa Cruz Biotechnologysc-376997חד-שבטי עכבר (דילול 1:1000), RRID:
AB_2813765<נוגדנים משניים>משניים
Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) (min X Bov, Ck, Gt, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rat, Shp Sr Prot) Jackson ImmunoResearch711-545-152חמור נגד ארנב (דילול 1:400), RRID: AB_2313584
AMCA AffiniPure Donkey Anti-Sheep IgG (H+L) (min X Ck, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rb, Rat Sr Prot)Jackson ImmunoResearch713-155-147חמור נגד כבשים (דילול 1:400), RRID: AB_AB_2340725
Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Goat IgG (H+L) (min X Ck, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rb, Rat Sr Prot)Jackson ImmunoResearch705-175-147חמור נגד עזים (דילול 1:400), RRID: AB_2340415
Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) (min X Bov, Ck, Gt, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Rb, Rat, Shp Sr Prot)Jackson ImmunoResearch715-175-151חמור נגד עכבר (דילול 1:400), RRID: AB_2619678
Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Sheep IgG (H+L) (min X Ck, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rb, Rat Sr Prot)Jackson ImmunoResearch713-175-147Donkey anti-Sheep (דילול 1:400), RRID: AB_2340730
<בדיקות רנסקופ חזקות>
קולטן גלנין 1 בדיקת אוליגונוקלאוטידACDBio448821-C1מכוונת bp 482 - 1669 (Genebank ref: NM_008082.2)
Glycine transporter 2 בדיקת אוליגונוקלאוטידיםACDBio409741-C3מכוון bp 925 - 2153 (Genebank ref: NM_148931.3)
בדיקת Phox2b oligonucleotideACDBio407861-C2מכוונת bp 1617 - 2790 (Genebank ref: NM_008888.3)

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14 (1), 22-29 (2012).
  2. Annese, T., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Fluorescence In Situ HybridizationImmunohistochemistryRNAscope FISHFresh Frozen TissueFixed Brain SectionsMultiplex LabelingProtein Subcellular LocalizationProtease TreatmentEpifluorescence MicroscopyBrainstem Nuclei

Related Articles