Intravitreale Injektion und Quantifizierung von Infektionsparametern in einem Mausmodell der bakteriellen Endophthalmitis

Summary

Wir beschreiben hier eine Methode der intravitrealen Injektion und der anschließenden bakteriellen Quantifizierung im Mausmodell der bakteriellen Endophthalmitis. Dieses Protokoll kann erweitert werden, um die Immunantworten des Wirts und die bakterielle und die Genexpression zu messen.

Abstract

Intraokulare bakterielle Infektionen sind eine Gefahr für das Sehvermögen. Die Forscher verwenden Tiermodelle, um den Wirt und bakterielle Faktoren und Immunantwortwege im Zusammenhang mit Infektionen zu untersuchen, um lebensfähige therapeutische Ziele zu identifizieren und Medikamente zu testen, um Erblindung zu verhindern. Die intravitreale Injektionstechnik wird verwendet, um Organismen, Medikamente oder andere Substanzen direkt in die Glaskörperhöhle im hinteren Segment des Auges zu injizieren. Hier demonstrierten wir diese Injektionstechnik, um Infektionen im Mausauge und die Technik der Quantifizierung von intraokularen Bakterien zu initiieren. Bacillus cereus wurde 18 Stunden lang in flüssigen Medien des Gehirns angebaut und auf eine Konzentration von 100 Koloniebildenden Einheiten (CFU)/0,5 l resuspendiert. Eine C57BL/6J-Maus wurde mit einer Kombination aus Ketamin und Xylazin anbeet. Mit einem Pikoliter-Mikroinjektor und Glaskapillarnadeln wurde 0,5 l der Bacillus Suspension in den mittleren Glaskörper des Mausauges injiziert. Das kontralaterale Kontrollauge wurde entweder mit sterilen Medien injiziert (chirurgische Kontrolle) oder nicht injiziert (absolute Kontrolle). Nach einer Infektion nach 10 Stunden wurden Mäuse eingeschläfert und die Augen mit einer sterilen chirurgischen Pinzette geerntet und in ein Rohr mit 400 l sterilen PBS und 1 mm sterilen Glasperlen gelegt. Für ELISAs oder Myeloperoxidase-Assays wurde den Röhrchen ein Proteinase-Inhibitor zugesetzt. Für die RNA-Extraktion wurde der entsprechende Lysepuffer hinzugefügt. Die Augen wurden in einem Gewebehomogenisator für 1-2 Minuten homogenisiert. Homogenate wurden in PBS seriell 10-fach verdünnt und auf Agarplatten verdünnt. Der Rest der Homogenate wurde bei -80 °C für zusätzliche Tests gelagert. Die Platten wurden 24 Stunden lang inkubiert und die KBE pro Auge quantifiziert. Diese Techniken führen zu reproduzierbaren Infektionen in den Augen der Maus und erleichtern die Quantifizierung lebensfähiger Bakterien, der Wirtsimmunantwort und der Omics der Wirts- und bakteriellen Genexpression.

Introduction

Bakterielle Endophthalmitis ist eine verheerende Infektion, die Entzündungen verursacht und, wenn sie nicht richtig behandelt wird, zu Verlust des Sehvermögens oder Erblindung führen kann. Endophthalmitis resultiert aus dem Eindringen von Bakterien in das Innere des Auges^1,2,3,4,5. Einmal im Auge, Bakterien replizieren, produzieren Toxine und andere schädliche Faktoren, und kann irreversible Schäden an empfindlichen Netzhautzellen und Gewebe verursachen. Augenschäden können auch durch Entzündungen verursach....

Protocol

Alle Verfahren wurden gemäß den Empfehlungen im Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren und der Association for Research in Vision and Ophthalmology Statement for the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research durchgeführt. Die Protokolle wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee des University of Oklahoma Health Sciences Center (Protokollnummern 15-103, 18-043 und 18-087) genehmigt.

1. Sterile Glasnadeln

1. Schalten Sie den Nadelpipette-Puller ein.
2. Stellen Sie den Heizknopf ein, bis das Display 12.6 anzeigt.
3. Öffnen Sie die Tür und füttern Sie d....

Results

Die Erzeugung eines reproduzierbaren Inokulums und die Genauigkeit des intravitrealen Injektionsverfahrens sind wichtige Schritte bei der Entwicklung von Modellen für mikrobielle Endophthalmitis. Hier haben wir das intravitreale Injektionsverfahren mit Gram-positivem Bacillus cereusdemonstriert. Wir injizierten 100 CFU/0,5 l B. cereus in die Mitte von fünf C57BL6-Mäusen. Nach 10 h Nachinfektion beobachteten wir ein intraokulares Wachstum von B. cereus auf ca. 1,8 x 10⁵ KBE/Auge.

Discussion

Trotz der Verfügbarkeit von potenten Antibiotika, entzündungshemmenden Medikamenten und Vitrektomie-Chirurgie kann bakterielle Endophthalmitis einen Patienten blenden. Klinische Studien waren nützlich bei der Untersuchung von Endophthalmitis; Experimentelle Modelle der Endophthalmitis liefern jedoch schnelle und reproduzierbare Ergebnisse, die in Fortschritte im Standard der Versorgung übersetzt werden können, was zu einem besseren visuellen Ergebnis für die Patienten führt.

Das Glaskörpervolu.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-20 & Mikro; L-Pipette	RANIN	L0696003G	NA
37oC Inkubator	Fisher Scientific	11-690-625D	NA
Bacto Gehirn Herz Infusion	BD	90003-032	NA
Zell-Mikroinjektor	MicroData Instrument, Inc.	PM2000	NA
Zange mit feiner Spitze	Thermo Fisher Scientific	12-000-122	NA
Glasperlen 1,0 mm	BioSpec	11079110	NA
Inkubatorschüttler	New Brunswick Scientific	NB-I2400	NA
Mikrokapillarpipetten 5 Mikroliter	Kimble	71900-5	NA
Mikropipette Anfaser	Sutter Instrument Co.	BV-10	NA
Mikroskop Axiostar Plus	Zeiss		NA
Mikroskop OPMI Lumera	Zeiss		NA
Mini-Beadbeater-16	BioSpec	Modell 607	NA
Mehrkanalpipette 30-300 & Mikro; L	Biohit	15626090	NA
Mehrkanalpipette 5-100 & Mikro; L	Biohit	9143724	NA
Nadel-/Pipettenabzieher	Kopf	730	NA
PBS	GIBCO 1897315		Protease-Inhibitor-Cocktail in molekularer Qualität
	Roche	4693159001
Molekulare Zange mit umgekehrter Wirkung	Katena	K5-8228	NA