Inyección intravítrea y cuantificación de parámetros de infección en un modelo de ratón de endoftlomitis bacteriana

Md Huzzatul Mursalin; Erin Livingston; Phillip  S. Coburn; Frederick  C. Miller; Roger Astley; Michelle C. Callegan

doi:10.3791/61749

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Artículo de método

Inyección intravítrea y cuantificación de parámetros de infección en un modelo de ratón de endoftlomitis bacteriana

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DOI:

10.3791/61749

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6 de febrero de 2021

Md Huzzatul Mursalin^*¹^,² , Erin Livingston^*¹ , Phillip S. Coburn²^,³ , Frederick C. Miller⁴ , Roger Astley²^,³ , Michelle C. Callegan¹^,²^,³

¹Department of Microbiology and Immunology, University of Oklahoma Health Sciences Center, ²Department of Ophthalmology, Dean McGee Eye Institute, ³Dean McGee Eye Institute, ⁴Department of Cell Biology and Department of Family and Preventive Medicine, University of Oklahoma Health Sciences Center

^* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Aquí describimos un método de inyección intravítrea y posterior cuantificación bacteriana en el modelo de ratón de endoftalmitis bacteriana. Este protocolo se puede extender para medir las respuestas inmunitarias del huésped y la expresión génica bacteriana y del huésped.

Resumen

Las infecciones bacterianas intraoculares son un peligro para la visión. Los investigadores utilizan modelos animales para investigar los factores huésped y bacteriano y las vías de respuesta inmune asociadas con la infección para identificar dianas terapéuticas viables y para probar fármacos para prevenir la ceguera. La técnica de inyección intravítrea se utiliza para inyectar organismos, fármacos u otras sustancias directamente en la cavidad vítrea en el segmento posterior del ojo. Aquí, demostramos esta técnica de inyección para iniciar la infección en el ojo del ratón y la técnica de cuantificación de bacterias intraoculares. Bacillus cereus se creció en medios líquidos de infusión de corazón cerebral durante 18 horas y resuspended a una concentración de 100 unidades formadoras de colonias (CFU) / 0,5 l. Un ratón C57BL/6J fue anestesiado usando una combinación de ketamina y xilazina. Usando un microinyector picolitr y agujas capilares de vidrio, se inyectó 0,5 l de la suspensión de Bacillus en el vítreo medio del ojo del ratón. El ojo de control contralateral se inyectó con medios estériles (control quirúrgico) o no se inyectó (control absoluto). A las 10 horas después de la infección, los ratones fueron eutanasiados, y los ojos fueron cosechados usando pinzas quirúrgicas estériles y colocados en un tubo que contiene 400 l de PBS estéril y perlas de vidrio estériles de 1 mm. Para elISA o ensayos de mieloperoxidasa, se añadió inhibidor de la proteinasa a los tubos. Para la extracción de ARN, se agregó el búfer de lelisis adecuado. Los ojos se homogeneizaron en un homogeneizador de tejido durante 1-2 minutos. Los homogeneados se diluyeron en serie 10 veces en PBS y la pista se diluyó en placas de agar. El resto de los homogeneizas se almacenaron a -80 oC para ensayos adicionales. Las placas se incubaron durante 24 horas y se cuantificó la CFU por ojo. Estas técnicas resultan en infecciones reproducibles en los ojos del ratón y facilitan la cuantificación de bacterias viables, la respuesta inmune del huésped y la omica de la expresión génica del huésped y del bacteria.

Introducción

La endoftalmitis bacteriana es una infección devastadora que causa inflamación y, si no se trata adecuadamente, puede provocar pérdida de la visión o ceguera. La endoftalmitis es el resultado de la entrada de bacterias en el interior del ojo¹^,²^,³^,⁴^,⁵. Una vez en el ojo, las bacterias se replican, producen toxinas y otros factores nocivos, y pueden causar daños irreversibles a las delicadas células y tejidos de la retina. El daño ocular también puede ser causado por inflamación, debido a la activación de vía....