Um protocolo aprimorado de tempo e trabalho-eficiente para o isolamento primário do hepatocito do rato

Resumo

Hepatócitos primários são uma ferramenta valiosa para estudar a resposta hepática e o metabolismo in vitro. Utilizando reagentes disponíveis comercialmente, foi desenvolvido um protocolo aprimorado de tempo e trabalho eficiente para o isolamento primário do hepatócito do rato.

Resumo

Hepatócitos primários são usados extensivamente em pesquisas in vitro hepáticas, especialmente em estudos de metabolismo de glicose. Uma técnica base foi adaptada com base em diferentes necessidades, como tempo, trabalho, custo e uso primário de hepatócitos, resultando em vários protocolos primários de isolamento hepatócito. No entanto, os numerosos passos e os preparativos demorados de reagentes no isolamento primário do hepatocitado são grandes desvantagens para a eficiência. Depois de comparar diferentes protocolos para seus prós e contras, as vantagens de cada um foram combinadas, e um protocolo rápido e eficiente de isolamento hepatócito primário foi formulado. Dentro de apenas ~35 min, este protocolo poderia produzir tanto, se não mais, hepatócitos primários saudáveis como outros protocolos. Além disso, os experimentos de metabolismo de glicose realizados usando os hepatócitos primários isolados validaram a utilidade deste protocolo em estudos in vitro de metabolismo hepático. Também revisamos e analisamos extensivamente a importância e o propósito de cada etapa deste estudo para que os futuros pesquisadores possam otimizar ainda mais esse protocolo com base nas necessidades.

Introdução

O fígado serve como um dos órgãos mais importantes no corpo de vertebrados devido ao papel vital que desempenha em inúmeras funções de suporte à vida, como digestão alimentar, circulação sanguínea e desintoxicação. O uso de hepatócitos primários de camundongos na cultura vitro é cada vez mais popular em estudos de metabolismo de carboidratos e carcinoma hepático. Por isso, é importante desenvolver um método conveniente para o isolamento primário do hepatocito do camundongo, mantendo sua função fisiológica inata. Devido à sua função como um centro do metabolismo da glicose, o fígado também é central para a produção e armazenamento^{de glicose 1....}

Protocolo

Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais johns Hopkins. Neste estudo, foram utilizados camundongos C57BL/6 fêmeas (8 semanas de idade).

1. Preparação:

1. Misture o William's E Medium (GlutaMAX Supplement) com 10% de FBS e 1% solução antibiótico-antimíctica para tornar a cultura média.
2. Filtrar 25 mL de meio de colagenase-dispase (por exemplo, Liver Digest Medium) através de um filtro de seringa de 0,45 μm para remover detritos de partículas.
3. Quente 50 mL de H₂O destilado duplo (ddH₂O), 35 mL de médio de perfusão (por exemplo, Médio de Per....

Resultados

Para testar a eficiência, foi realizado o presente protocolo primário de isolamento do hepatocito em camundongos C57BL/6 femininos de 8 semanas. O apego e a pureza dos hepatócitos primários isolados foram testados. O isolamento primário do hepatócito é usado para uma grande variedade de experimentos em fisiologia hepática, como efeitos hepáticos de drogas e metabolismo de glicose, atividade biomarcadora farmacêutica², sensibilidade à insulina e produção de glicose. Portanto, as atividades dos hepa.......

Discussão

Vários protocolos primários de isolamento de hepatocitas foram desenvolvidos. Eles também foram mantidos otimizados e adaptados com base em diferentes necessidades (Tabela 1). Os protocolos de isolamento são geralmente compostos de duas partes: perfusão (incluindo digestão enzimápica) e purificação.

A perfusão pode ser realizada com todo o fígado in vivo 2,20,21,22,23 ou com lóbulos hepáticos dissecados ^<.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
1x PBS	Gibco	10010023
10x HBSS	Gibco	14065-056
Placa de 12 poços	FALCON	353043	Revestimento não necessário
Placa de 6 poços	de 353046	FALCON	não necessário
	Sinalização Celular	2920S
(100x), Estabilizada	Sinalização	A5955
		97635S
anti-GAPDH	Sinalização celular	2118S
anti-p-AKT (S473)	Sinalização celular	9271L
anti-PEPCK	Santa Cruz	SC-166778
anti-p-FOXO1 (S256)	Sinalização celular	84192S
Filtro de células, 70 µ m	CELLTREAT	229483
Cateter IV Fechado, 24 Gauge 0.75 IN	Becton Dickinson	383511
DMEM, sem glicose, sem glutamina, sem vermelho de fenol	ThermoFisher Scientific	A1443001
EnzyChrom	BioAssay Systems	EBGL-100
Fetal Bovine Serum (FBS)	Hyclone	SH30071.03
Forskolin	MilliporeSigma	F3917-10MG
Glucagon	Sigma-Aldrich	G2044
Cabra Anti-rato IgG Anticorpo Secundário	LI-COR	926-68070
Cabra Anti-coelho IgG Anticorpo Secundário	LI-COR	926-32211
GraphPad Prism 8	GraphPad Software	NA
Hepatócito Lavagem Médio	Gibco	17704-024
IBMX	Cell Signaling	13630S
	Insulina Lilly	NDC 0002-8215-01
Cetamina HCL (100 mg/mL)	Hospira Inc	NDC 0409-2051-05
L-Glutamina	Gibco	25030081
Fígado Digest Médio	Gibco	17703-034	Alíquota dentro do capuz de cultura de tecidos para 25 mL cada em tubo de 50 mL e manter em -20 ° C freezer
Fígado Perfusão Medium	Gibco	17701-038
Caneta Strep	Gibco	15140122
Percoll	GE Healthcare	17-0891-01
Bomba Peristáltica	Gilson	Minipuls 2	Capaz de bombear a 4 mL/min
Placa de Petri	Fisherbrand	08-757-12
Centrífuga	RefrigeradaSorvall	Legend RT	Capaz de centrifugar tubo de 50 mL a 4 & C
L-lactato de Sódio	Sigma-Aldrich	L7022
Piruvato de Sódio	Gibco	11360070
Seringa Filtro, PVDF 0.45 µ m	CELLTREAT	229745
Becton Dickinson	329461		de 0,5 mL
Becton Dickinson	309653		60 mL
de 15250061		Gibco	0,4%,
de 430052		Corning	de 15 mL
Corning	430290		50 mL
Tanque de banho	Corning	CLS6783	Ou qualquer tanque de banho-maria capaz de aquecer até 45 > C
Guilherme' s E Medium (Suplemento GlutaMAX)	Gibco	32551020
Xilozina (100 mg/mL)	Vetone Anased LA	NDC13985-704-10

Revestimento anti-AKT Solução Antimistótica Antibiótica de celular anti-FOXO1 Sigma-Aldrich Kit de ensaio de glicose Seringa de 30 mm de diâmetro, seringa , solução Trypan Blue de, tubo tubo , água de