PCR 돌연변이 발생, 복제, 발현, 빠른 단백질 정화 프로토콜 및 트립토판 신타제의 야생 유형 및 돌연변이 형태의 결정화

Eduardo Hilario; Li Fan; Leonard  J. Mueller; Michael  F. Dunn

doi:10.3791/61839

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방법 논문

PCR 돌연변이 발생, 복제, 발현, 빠른 단백질 정화 프로토콜 및 트립토판 신타제의 야생 유형 및 돌연변이 형태의 결정화

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DOI:

10.3791/61839

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2020년 9월 26일

Eduardo Hilario¹ , Li Fan² , Leonard J. Mueller¹ , Michael F. Dunn²

¹Department of Chemistry, University of California-Riverside, ²Department of Biochemistry, University of California-Riverside

이 논문에서

요약

이 문서는 살모넬라 타이피무륨 트립토판 synthase의 발현 및 정화를 위한 일련의 연속적인 방법을 제시하며, 이 프로토콜은 하루에 단백질 복합체를 정화하는 신속한 시스템이다. 커버되는 방법은 현장 지향 돌연변이 발생, 대장균의단백질 발현, 친화 성염색로그래피, 젤 여과 크로마토그래피 및 결정화입니다.

초록

살모넬라 타이피무륨의 트립토판 신체(TS) 바이엔자임 복합체(α₂β₂ TS)를 함유한 구조 연구는 촉매 메커니즘, 알로스터식 거동, 그리고 PLP 의존 효소에서 제품에 기판의 효소 변환에 대한 세부 사항을 더 잘 이해하기 위해 수행되었습니다. 이 작품에서, 고립된 α 및 고립된 β 서브유닛을 생성하는 새로운 표현 시스템은 2일 이내에 고립된 서브유닛으로부터 고량의 순수 서브유닛과 α_{2 β}₂stTS 콤플렉스의 정화를 허용하였다. 정제는 친화성 크로마토그래피에 의해 수행되었고, 그 다음으로 친화태그, 황산암모늄 강수량 및 크기 배제 크로마토그래피(SEC)의 분열이 뒤따랐다. 효소 β 부위의 주요 잔류물의 역할을 더 잘 이해하기 위해, 현장 직접 돌연변이 발생은 이전 구조 연구에서 수행되었다. 또 다른 프로토콜은 야생 유형과 돌연변이 α₂β₂세인트TS 단지를 정화하기 위해 만들어졌습니다. 암모늄 황산염 분획 및 SEC를 사용하는 간단하고 빠르고 효율적인 프로토콜은 하루에₂β₂StTS 단지의 α 정화할 수 있었습니다. 이 작업에 기재된 두 정제 프로토콜은 이전 프로토콜과 비교하여 PEG 8000및 spermine을 사용하여 동일한 복합체를 정화하여 정화 프로토콜을 따라 α₂β₂stTS 단지를 결정화할 때 상당한 이점이 있다. 야생 유형 및 일부 돌연변이 형태의 결정화는 PEG 8000 및 spermine을 사용하여 일부 돌연변이체의 정제를 손상시키는 약간 다른 조건에서 발생합니다. 엑스레이 결정학 연구에 적합한 결정을 준비하기 위해 결정화, 결정 품질 및 냉동 보호를 최적화하기 위해 몇 가지 노력을기울였습니다. 여기에 제시 된 방법은 일반적으로 트립토판 synthase 서브 유닛과 야생 유형 및 돌연변이 α₂β₂세인트TS 단지의 정화에 적용해야합니다.

서론

트립토판 신타제(TS) 바이엔자임 복합체(α_{2 β 2)는}알로스터 효소로, 박테리아, 식물, 곰팡이^1,^2,^3에서아미노산 L-트립토판의 생합성에서 마지막 두 단계를 촉매한다. 박테리아 살모넬라 장내 세로바 티피무리움 (St)은인간과 다른 동물에서 심각한 위장 감염을 일으킨다. 인간과 더 높은 동물은 TS(EC 4.2.1.20)가 없기 때문에, S. typhimurium α₂β₂ TS 복합체 (α₂β₂StTS)의 억제는 크립토스포리디오스및 결핵^4,생식기 및 안구 감염^5,그리고^잠재적인 그녀의 발동을 위한 잠재적 인 약물 대상으로 탐구되었습니다. α 서브유닛은 인돌-3-글리세롤-인산염(IGP)의 알돌리틱 분열을 글리세랄데히드-3-인산염(GAP)과 인돌로 촉매하여, 인돌닌 타우토머 중간체및 그 후 카본-카본 결합 분....