Summary
מודלים מכרסמים רבים של אנדומטריוזיס מוגבלים על ידי מורכבות טכנית, רבייה, ו / או צורך בעלי חיים immunocompromised או עכברי כתב מיוחד. אנו מציגים מערכת פשוטה של אינדוקציה נגע באמצעות כל עכבר ניסיוני עם מערכת ניקוד אובייקטיבית הניתנת לאימות עצמאי וללא דרישה לכריתת שחלות או ניתוח הישרדות.
Abstract
אנדומטריוזיס היא הגורם המוביל לכאב באגן ולאי פוריות. זה מוגדר על ידי נוכחות של רקמת רירית הרחם במקומות חוץ רחמיים. הפיתוח של עיבודים חדשניים וכלי אבחון עבור אנדומטריוזיס הוגבל בין היתר בשל אתגרים בחקר המחלה. מחוץ לפרימטים, יונקים מעטים וסת, ואף אחד מהם לא מפתח אנדומטריוזיס ספונטני. דגמי מכרסמים פופולריים אך דורשים אינדוקציה מלאכותית של אנדומטריוזיס, כאשר רבים משתמשים בעכברים אימונו-קוםיים או במחלה הנגרמת בניתוח. לאחרונה, תשומת לב רבה יותר ניתנה מודלים מעורבים הזרקה תוך אינטריתוניאלית. אנו מציגים מודל מורין של אנדומטריוזיס המשלב מספר תכונות של מודלים אנדומטריוזיס קיימים לתוך מערכת חדשנית, פשוטה המסתמכת על כימות מיקרוסקופי במקום דירוג סובייקטיבי. במודל זה, אנו מבצעים גירוי הורמונלי של עכברים תורמים, הזרקה תוך-פטרייתונית, סקר בטן שיטתי וקציר רקמות, וכימות היסטולוגי שניתן לבצע ולאמת בכל עת לאחר נמק. מודל זה דורש משאבים והכשרה מינימליים; אינו דורש מומחיות על ידי טכנאי מעבדה בניתוח הישרדות מורין או בזיהוי נגעים אנדומטריוטיים ברוטו; ניתן להשתמש בעכברים אימונו-קומונימציה, חיסונית ו/או מוטנטיים; ויוצר באופן אמין נגעים אנדומטריוטית התואמים היסתולוגית למחלה אנדומטריוטית אנושית.
Introduction
אנדומטריוזיס היא מחלה מסתורית של מערכת הרבייה הנשית עם נטל כלכלי ובריאותי משמעותי על נשים1,2. האטיולוגיה של אנדומטריוזיס אינה מובנת לחלוטין, והוצעו הסברים מרובים כולל מטאפלזיה קולומית, מנוחה מולרית עוברית, גיוס תאי אב נגזרים מח עצם, וסת מדרדרת3. בעוד היבטים מרובים של מנגנונים מוצעים אלה עשויים להיות מעורבים, ואין הסבר אחד יכול להסביר את כל צורות המחלה, המודל המוביל של אנדומטריוזיס פתוגנזה הוא וסת מדרדרת. הווסת המדרדרת היא מעבר של שפכים וסת דרך החצוצרות לתוך חלל הצפק; ההערכה היא כי 90% מהנשים במחזור עוברות באופן קבוע וסת מדרדרת4,5. בהתחשב בתופעה הנפוצה הזו של הווסת המדרדרת, מדוע אנדומטריוזיס מתפתחת רק בתת קבוצה של נשים לא ברור5. כדי להבין טוב יותר את האטיולוגיה של מחלה זו, מחקרים אנושיים ישירים אינם אפשריים ומחקרים בבעלי חיים מוצדקים.
אנדומטריוזיס הוא אתגר הן לטפל והן ללמוד. שכיחות המחלה אינה ידועה אך מוערכת ב -10%1. בעוד כמה סוגים מתקדמים של אנדומטריוזיס עשויים להיות מזוהים במדויק באמצעות הדמיה לא פולשנית, אבחנה סופית מושגת רק באמצעות ניתוח היסטופתולוגי של דגימות ביופסיה שהושגו בניתוח; נגעים שנראים חזותית להיות חולה, עשוי למעשה להיות פיברוזיס או הצטלקות מסיבות אחרות6. חומרת והיקף המחלה אינו תואם עם סימפטומטולוגיה7.
נגעים אנדומטריוזיס מורכבים מסוגי תאים הטרוגניים ואוכלוסיות אשר אינטראקציה בדרכים מורכבות בתוך microenvironment, ולכן, הגבלת התועלת של מודלים הסלולר8,9. במודלים של Vivo קיימים, אבל אלה יש אתגרים ומגבלות מובנים10,11,12. דגמי פרימטים הם אידיאליים אך לעתים קרובות אינם אפשריים13,14,15. מעט יונקים שאינם פרימטים וסת ומפתחים אנדומטריוזיס באופן ספונטני16. מודלים מכרסמים של אנדומטריוזיס קיימים אבל כל אחד יש מגבלות17. רבים מהמודלים הללו דורשים ניתוח הישרדות לתפר או להשתיל רקמת רירית הרחם בקיר או במעי של הנמען התורם, הוספת מורכבות טכנית, צורך בהרדמה וגורמים חיסוניים מבלבלים מהניתוח עצמו18,19,20. בנוסף, מודלים רבים דורשים כריתת השחלות ותוספת אסטרוגן; תוך הגדלת תפוקת הנגעים, הדבר מוסיף זמן, הוצאות וניתוח הישרדות נוסף. מודלים הזרקה intraperitoneal (IP) אינם דורשים הרדמה או ניתוח הישרדות, ומודלים אלה באופן הגיוני לדמות וסת מדרדרת טוב יותר מאשר מודלים תפירה21,22,23. רוב מודלי ה- IP, לעומת זאת, כפופים לשונות רבה יותר במיקום הנגע עקב פיזור אקראי של שברי רירית הרחם לאחר ההזרקה ולכן להטיה רבה יותר בזיהוי ומדידת נגעים.
כאן אנו מציגים מודל מורין של אנדומטריוזיס המשלב מספר תכונות של מודלים אנדומטריוזיס קיימים לתוך מערכת חדשנית, פשוטה ויעילה המסתמכת על כימות מיקרוסקופי במקום דירוג סובייקטיבי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: השימוש בבעלי חיים במחקר זה אושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש (IACUC) במכון המחקר קליבלנד קליניק לרנר. כל תקני הטיפול והשימוש בבעלי חיים הזמינים לציבור בוצעו בהתאם להנחיות של המכונים הלאומיים לבריאות. הליך זה משתמש בטכניקות אספטיות. צלחת הפטרי סטרילית. PBS / מלוחים בשימוש הוא סטרילי. המכשירים הכירורגיים לנמק וניתוח רקמות מעוקרים באמצעות autoclave. אנו משתמשים 70% EtOH על המכשירים בין מקרי בעלי חיים (אם יותר מאחד לכל מפגש) כדי להפחית את הזיהום.
1. הכנת עכברים תורמים ומקבלים (ראו איור 1)
- ודא כי אישור מתאים הוא במקום לעבוד עם חיות מעבדה.
- קבע את זן העכבר. בניסויים אלה נוצלו שימוש בעכברים מסוג בר ועכברים מוטנטיים בעלי רקע C57BL/6J, אך חוקרים המשתמשים במודלים דומים מדווחים על הצלחה עם זני עכבר אחרים כגון עכברי BALB/c10. בנוסף, עכברים תורמים ו/או נמענים יכולים להשתמש במערכות עיתונאיות, כגון עכברי GFP או RFP (ראו איור 2 ואיור 3).
- לתזמון של השתלת רקמת רירית הרחם, ודא כי העכברים התורמים הם בין 22-24 ימים בזמן הזרקת גונדוטרופין. זה מבטיח כי הם נאיביים פוריות, למשל, עדיין לא התחיל estrous רכיבה על אופניים.
- ודא כי העכברים הנמענים הם שלמים פוריות (ללא כריתת השחלות הקודמת) בין 2 ל 4 חודשים של גיל. אמנם לא נדרש, מומלץ למקם מצעים ספוגים בשתן מכלוב עכברים זכר מעת לעת בכלוב של המטופל כדי להקל על רכיבה מתמשכת על אופניים estrous ושוב בשעה 72 שעות לפני השתלת רקמת רירית הרחם.
הערה: זה לא יבטיח סנכרון של מחזור אסטרוס של הנמענים, כמו מצעים ספוגים בשתן מיקום תלוי מאוד בכמות המצעים הגבריים המשמשים ויש תוצאות משתנות. אם סנכרון של מחזור אסטרוס הוא הרצוי, שלוש זריקות תת עוריות רצופות של 100 ng/100 μL אסטרדיול יביא את כל בעלי החיים לשלב אסטרוס. אמנם לא מצאנו הבדל באינדוקציה נגע בהתבסס על שלב מחזור estrous, קבוצות אחרות מצאו את שלב המחזור להיות חשוב10. - להזריק באופן תת עורי סרום סוסה בהריון גונדוטרופין (PMSG, 2 IU מדולל לתוך 200 μL) לתוך עכברים תורם תת עורית באמצעות מחט עדינה (25-27 G מומלץ). אל תיתן PMSG לעכברים המטופלים, כפי שהוא יפעיל ביוץ וסביבת פרוגסטרון גבוהה לאחר מכן, אשר פחות פתוח להיווצרות אנדומטריוזיס.
הערה: דגמי עכבר קודמים השתמשו PMSG או אסטרוגן כדי לעורר את התפשטות רירית הרחם בעכברים התורמים לפני קציר רירית הרחם23. PMSG מומלץ מהסיבות הבאות: מחצית החיים של PMSG היא 40 שעות ואילו מחצית החיים של 17-בטא אסטרדיול הוא רק 2 שעות. ניצול הזרקה תת עורית אחת של PMSG בתורמים 40 שעות לפני רכישת רקמת רירית הרחם מספק משך מתמשך של חשיפה לגיורוי גונדוטרופין, הפועל להמרצת אסטרוגן אנדוגני. תכשירים רבים של אסטרוגן אקסוגני דורשים זריקות מרובות כדי הממשלה כראוי את רירית הרחם. - לאחר הזרקת PMSG, לתזמן נמק, רכש, והשתלה לתוך המטופל בין 38-42 שעות. זמן קציר רקמת רירית הרחם בעקבות הזרקת גונדוטרופין כדי להבטיח איסוף של רקמות לפני הביוץ, אשר מתרחשת ב 42 שעות לאחר הזרקה. הביוץ מייצר סביבת פרוגסטרון גבוהה (P4), אשר יפחית את הקמת הנגע.
2. רכש של רקמת רירית הרחם של העכבר התורם
- לאחר המתת חסד של עכבר תורם (באמצעות CO2 תא ואחריו נקע צוואר הרחם), לרסס את הבטן עם פתרון אתנול 70%; זה משמש כדי להפחית את הזיהום של הרקמה שנרכשה מן הצומח העור מן השערות מפורק. עם מספריים ניתוח, לעשות חיתוך רוחבי רדוד בקו האמצע דרך העור ורקמות תת עוריות. לאחר מכן תופס כל צד של חתכת העור, להשתמש במתיחה קהה כדי לפתוח את הבטן.
- זהה את הרחם. לפני הסרת הרחם, לקצץ את רקמת החיבור הסמוכה. ניתחו כל קרן הרחם ממש מתחת לצינור החצוצרות שלהם ואז העבירו את צוואר הרחם כדי להסיר את כל הרחם en הגוש.
- לאחר הסרה מחלל הבטן, יש לבדוק את הרחם בקפידה ולהסיר כל שומן היקפי נוסף או רקמת חיבור. מניחים את הרחם בטיפת PBS קרה על צלחת פטרי. קבעו ותיעדו את המסה המשולבת של הרחם כולו.
- ניתחו כל קרן מהרחם, מה שהופך את הטרנסקציה קרוב ככל האפשר לקרן כדי למקסם את אורך כל קרן. בעזרת מיקרוסקופ מנתח, הנח להב אחד של המספריים הניתוח בתוך הלומן של הקרן הראשונה, ולאחר מכן חתוך לאורך הציר העיקרי של הצינור. פתחו בזהירות את הצינור, תוך התחשבות באיזה צד הוא הסרוזה ובאיזה צד האפיתל.
- שים 500 סמ"ק של תמיסת מלח או PBS על צלחת פטרי חדשה; הנוזל יישאר יחד עקב מתח פני השטח.
- לאחר מכן, לבצע פיצול של הרחם בצורה אחידה. עדיף שיהיו פחות נגעים גדולים יותר מאשר נגעים קטנים רבים. התחל על ידי הפרדת האפיתל מן myometrium על ידי אחיזת שכבת רירית הרחם וקילוף אותו משם.
- לחלופין, פשוט לפצל את הרקמה מבלי להפריד את myometrium (כל עוד הצד האפיתל חשוף לחלוטין), אבל שמירה על myometrium מפחית את הרלוונטיות הפיזיולוגית של מודל זה למחלה אנושית. ודא כי שברים גדולים ככל האפשר אבל קטן מספיק כדי לעבור דרך מחט 18 G; (מומלץ 1 מ"מ x 1 מ"מ).
- לאסוף 10-12 אלה 1 מ"מ x 1 מ"מ שברים מן הקרן הראשונה (אשר בערך מתאים 40 רקמה מ"ג בעכברים C57BL / 6J). מניחים שברים שנאספו לתוך האוסף הנוזלי.
- בצע את אותם שלבים עבור קרן הרחם האחרת עבור סך של כ 24 קטעים לכל עכבר. תעד את המספר הכולל של קטעים.
3. הזרקה צפקית של שברי רקמות לעכבר המטופל
- שאפו את שברי 1 מ"מ x 1 מ"מ תלויים באמצעות הקצה הקהה של מזרק 1 סמ"ק; אמצעי האחסון הכולל צריך להיות 1 מ"ל.
- חבר מחט 18 G למזרק המלא ולהעמיס את הנוזל לתוך המחט. שקול זריקה מדומה בחזרה לתוך צלחת פטרי כדי להבטיח כי כל הרקמה תעבור דרך המחט.
- קח את העכבר של הנמען. לפני או אחרי הזרקת IP, להשיג מריחה בנרתיק של העכבר הנמען עבור תיעוד מחזור אסטרוס (10 μL של מלוחים באמצעות מזרק הנורה ב פתח הנרתיק מצופה על שקופית הזכוכית עם כיסוי).
- בצע הזרקה תוך-תאית של השברים עם המזרק בזווית של 45 מעלות, תוך הקפדה לא להזריק תת עורית.
- אם שברים נשארים לאחר הזרקה, לצייר 200 μL נוסף של הנוזל לתוך המזרק להזרקה כדי להבטיח כי כל השברים מוזרקים בהצלחה תוך איפריטונית.
- לאחר שהובטחו ללא דימום או סיבוכים, החזירו את העכברים הנמענים לכלובים שלהם והזינו תזונה רגילה.
4. קציר נגעים אנדומטריוטיים
- המת חסד עכברים נמענים בכ 21 ימים לאחר הזרקת שבר לאחר ההשתלה.
הערה: מניסיון ומדיון עם משתפי פעולה באמצעות מודלים דומים, גודל הנגע המרבי ומספר מתרחשים בערך 3 שבועות לאחר ההשתלה; לאחר 3 שבועות, נגעים מתחילים לסגת בגודל. השיטה המאושרת של IACUC של המתת חסד משמשת. - לאחר המתת חסד ונקע צוואר הרחם, לרסס את הבטן של החיה עם 70% אתנול אוהל העור לחתוך באופן שטחי עם מספריים לנתח. תעוררו את העור ואת החלל התת עורי עם מספריים כדי לפתוח את הבטן בבוטות.
- לפני כל ניתוח נוסף מתבצע, סקר מלא עבור נגעים ברוטו מבוצע, עם גודל נמדד על ידי calipers ומתועד לגבי האזור האנטומי שלהם (ראה להלן).
- בצע אוסף מלא של שלושה אזורים אנטומיים נפרדים en גוש (ללא קשר אם נגעים ניתן להעריך ברוטו). אם נגעים נראים באזורים אחרים (למשל, מעיים), יש להתעלם מהם ולא לאסוף אותם אלא אם הנגע חוצה את אחד משלושת האזורים שמתחת.
- A = דופן הבטן / צפק (ניתן לשטח לתוך קלטת או מגולגל, כל עוד עקבי בין דגימות).
- B = לבלב ושומן מזנטי.
- C = רקמת חיבור parauterine ושומן (רקמה נוצצת לבנה המקיפה את הרחם אך אינה מערבת איברים מלבד שלפוחית השתן; יש להקפיד לא לטעות בשלפוחית השתן לגע).
- מקם כל אזור נותח בקלטת, המסומנת כראוי, והכנס אותו לפורמלין ולעבד לפי פרוטוקול מעבדה לחתך היסטולוגי.
- מקטע פורמלין בלוקים בשתי שקופיות (D1 ו- D2) לכל אזור רקמה בשני עומקים אחידים.
5. ניקוד של נגעים אנדומטריאוטיים
- סרוק (בהגדלה של פי 40) ואחסן בארכיון שקופיות.
- השתמש בתוכנת קריאת שקופיות דיגיטלית, הגדר את המרחק הארוך ביותר (X) בין קצוות של נגע אנדומטריוטי - בין אם הקצה מורכב מבלוטות או סטרומה- וסמן אותו. נגע מתמשך מוגדר על ידי בלוטות מוקפות סטרומה; הקו אינו חוצה בהכרח רק רקמה אנדומטריוטית (כמו במקרה של קביעת נקודות קצה על מוקד צורה לא סדיר או גלי של אנדומטריוזיס) אך שתי נקודות הקצה צריכות להיות מחוברות על ידי סטרומה ו/או בלוטות רציפה (ראו איור 4).
- הפוך שורה שנייה (Y) 90 מעלות על פני השורה הראשונה, עם אורך השורה השנייה נקבע בהתאם לכללים לעיל.
- אם נתקלים במגוון נגעים לא רציפים, תן לכל אחד מדידות X ו- Y משלו.
- חשב את הניקוד הסופי עבור כל שקופית כסיכום אזורים (X*Y) של כל נגע.
- קח את התוצאות הגדולות יותר משתי השקופיות (D1 לעומת D2) כציון הסופי עבור אזור זה (A, B, C).
- סה"כ את הציונים מכל אזור כדי לתת את הציון המיקרוסקופי הסופי עבור החיה הזו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
לניסוי ראשוני להוכחת הרעיון, רירית הרחם התורמת מעכברי RFP הוזרקה לעכברים נמענים מסוג בר. כתמי H&E חשפו אישור היסטופתולוגי של ארכיטקטורה קלאסית של נגע אנדומטריוזיס(איור 3A). מיקרוסקופיה פלואורסצנטית אישרה כי הנגע הנצפה המדובר מקורו בתורם (איור 3B).
הניסוי השני בוצע באמצעות 10 תורמי C57BL/6J של Wildtype ו-10 נמענים. 5 נמענים נוספים קיבלו טיפול מזויף (מוזרק עם PBS ולא שברי רירית הרחם) והקצו להם מספר זיהוי אקראי; הסוקרים היו עיוורים לפני נמק וסקירה היסטופתית.
כל המקבלים קיבלו רקמת רירית הרחם התורם בתוך 42 שעות של טיפול תורם PSMG. לא היה קשר בין מרווח זמן זה לבין משקל הרחם הסופי או גודל הנגע. בזמן רכישת התורם, משקל הרחם הכולל הממוצע היה 54 ± 9.5 מ"ג. מספר הקטע הממוצע היה 22.4 ± 5.2, וכתוצאה מכך משקל שבר ממוצע של 2.5 ± 0.5 מ"ג. ניתוח נקודת קצה התרחש ביום 20 או יום 22 עבור כל הנמענים.
עם מספר ממוצע של נגעים של 1.5 וקוטר הנגע הכולל ברוטו הממוצע של 3.7 מ"מ, נקודות קצה אלה דומות למחקרים אחרים המשתמשים במודלים של עכבר עם משקל דומה של שברי רירית הרחם המוזרקים (איור 2)10. השכיחות של נגעים לכל העכברים הייתה 80%. העכברים ללא נגעים היו שבר רירית הרחם גדול משמעותית לעומת עכברים עם נגעים (30.5 שברים הכולל לעומת 20.3, בהתאמה; שברים הכולל הממוצע עבור כל העכברים היה 22.4) וכתוצאה מכך מתחת לגודל שבר הממוצע בזמן ההזרקה (1.9 מ"ג לעומת 2.6 מ"ג). כצפוי, פקדי זיוף (מוזרקים עם תמיסת מלח ולא שברי רירית הרחם) לא היו מחלה ברוטו או מיקרוסקופית. במחקר שלאחר מכן באמצעות מספר מורחב של עכברים, שלב אסטרוס של העכבר הנמען לא היה קשור למספר נגע או ציון מחלה מיקרוסקופית.
מספר הנגע הגס נראה כסמן פונדקאי גרוע לנטל הנגע הכולל, שכן הייתה מחלוקת בין המקרוסקופי למחלה המיקרוסקופית הקיימת ברקמות. ב-60% (n = 6) מהמקרים, הייתה הסכמה בין הניקוד המקרוסקופי והמיקרוסקופי (ההסכם שהוגדר הן כהצגת נוכחות או היעדרות וההבדל בגודל הכולל היה בטווח של 3 מ"מ). עם זאת, ב 40% (n = 4) של המקרים, היו חילוקי דעות, עם 10% (n = 1) של המחלה המקרוסקופית זמן נעדר אבל מחלה מיקרוסקופית היה נוכח על ידי היסתולוגיה, 10% (n = 1) מחלה מקרוסקופית נראתה למרות היעדר אנדומטריוזיס על ההטולוגיה המאשרת (איור 5), ואת 20% הנותרים (n = 2) היה הסכם בנוכחות אך לא גודל הנגע. לכן, בדיקה מקרוסקופית עבור נגעים לבד אינו מספיק לכימות של נטל מחלת אנדומטריוזיס.
איור 1: מבט כולל על המודל. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: אזורים שנסקרו לכימות נגעים. בעוד המעי ומיקומים תוך-איטרא-איפטיוניים אחרים יכולים להכיל נגעים, זה יותר מאתגר להבחין אלה בצורה גסה וסקר ממצה של הבטן יהיה יותר זמן אינטנסיבי עם תשואה פוחתת. לכן, גישה עקבית ושיטוכית של קצירת הרקמה המלאה (ללא קשר אם קיימת מחלה גסה) מבוצעת בשלושת האזורים הנפוצים ביותר של היווצרות אנדומטריוזיס: דופן הבטן / צפק (A), הלבלב והשומן המזנטרי (B), ואת שומן הרחם (C). מתויגים תמונות מייצגות של ממצאים מיקרוסקופיים של נגעים מכל אחד משלושת האזורים. הגדלה פי 40. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: אינדוקציה של אנדומטריוזיס באמצעות רירית הרחם של עכברים תורמים המבטאת חלבון פלואורסצנטי אדום. (א)קטע H&E של הנגע. (B)מיקרוסקופיה פלואורסצנטית עם כתמי DAPI. הגדלה פי 40. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: תמונות מייצגות של התוכנה המשמשת למדידת ממדי הנגע וכימות נטל הנגע. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: דגימות מייצגות של "נגעים" ברוטו שאינם אנדומטריוזיס על ידי בדיקה היסטופתולוגית. הגדלה פי 40. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
המחקר שלנו מדגים כי אנדומטריוזיס יכול להיות מושרה באופן אמין בעכברים ללא צורך בשימוש ב כריתת השחלות ו/או ניתוח הישרדות, וכי נגעים רירית הרחם חוץ רחמית ניתן לזהות ולכמת באמצעות סקר סטנדרטי של הבטן וניתוח היסטולוגי.
מחקרים מוריניים רבים של אנדומטריוזיס לנצל אנדומטריוזיס המושרה בניתוח שבו אנדומטריום התורם נתפר במקום המעי, דופן הבטן, או מיקום תוך-איפריטוניאלי אחר12,20. זה יש את היתרון של סטנדרטיזציה הגודל והמיקום של הרקמה המושתלת. עם זאת, בנוסף לאתגרים לוגיסטיים נוספים של ניתוח הישרדות, זה עשוי להכניס משתנים מבלבלים מהניתוח עצמו, בהתחשב בכך אנדומטריוזיס היא מחלה דלקתית וכי בסביבה קלינית, אנדומטריוזיס מתפתח בדרך כלל לפני כל הליך כירורגי. הזרקה תוך-פטרייתונית, לעומת זאת, מדגמנת בצורה מדויקת יותר את הווסת המדרדרת שנחשבת כגורמת לרוב נגעי אנדומטריוזיס.
Ovariectomy מבוצעת לעתים קרובות בדגמי מכרסמים כדי להפחית את השונות שהוצגה על ידי מחזור אסטרוס; וכמו אנדומטריוזיס היא מחלה תלוית הורמונים, מינונים על-פיזיולוגיים של אסטרדיול מנוהלים לאחר מכן במקרים אלה. פרקטיקה זו מגבילה את תחולת מודל העכבר למחלות אנושיות. המחקר שלנו מדגים כי ovariectomy אין צורך ליצור באופן אמין נגעים אנדומטריוזיס וכי שלב של מחזור אסטרוס אינו משפיע על היכולת להקים נגעים.
מחסור במודלים אחרים של הזרקה תוך-איפטיונית הוא ההסתמכות על אמצעים סובייקטיביים של גודל הנגע או הנטל. בעוד שהשימוש בקליפרים או במכשירים אחרים עשוי לספק אמצעים אובייקטיביים, מדידות אלה נרשמות בזמן קציר הנגע ולכן אינן ניתנות לאימות מאוחר יותר ועשויות להיות כפופות לשונות פנים-צופה. במודל שלנו, כימות היסטולוגי יכול להתבצע ולאמת הרבה אחרי נמק, כלומר אלה המבצעים את הנמק לא צריכים להיות בעלי מומחיות בזיהוי נגעים גסים והם עיוורים בקלות רבה יותר לגבי ההתערבות שהתקבלה. יתר על כן, כפי שממחישה עבודתנו, חלק מהמחלות עלולות להחמיץ רק כאשר הם מסתמכים על מחלות גסות; בנוסף, נגעים חשודים רבים עשויים להיות למעשה פיזיולוגיים (למשל, רקמת לימפה) או פיברוזיס. לבסוף, לקיחת חלקים סטנדרטיים של אזורים אנטומיים שלמים בכל עכבר מפחיתה עוד יותר את השונות. גישה זו של רכישת אותה כמות של רקמה לעכבר מונעת את ההדגשה הבלתי נמנעת שתתרחש עם דגימות קטנות ואת ניקוד יתר של דגימות גדולות, במיוחד מאז מחלה מיקרוסקופית עשויה להיות נוכחת.
בסופו של דבר, עידונים אלה משמשים הן לתקנן ולפשט את הגישה, וכתוצאה מכך מודל עכבר שיכול ללמוד אנדומטריוזיס בצורה תפוקה גבוהה. מודל זה הוא שיטה ניתנת לבדיקה כדי לסנן עבור מסלולים ויעדי סמים, והמעבדה שלנו משתמשת כרגע במודל זה למחקר אימות סמים. מודל זה מועיל במיוחד כאשר מנסים לקבוע את החשיבות היחסית של ביטוי גנים חריג (או טיפול תרופתי) באנדומטריום התורם לעומת הסביבה הצחית של הנמען. זה גם יכול להיות מנוצל עם עכברי כתב (כפי שהראינו) ועכברים immunocompromised ונוקאאוט.
לסיכום, אנו מספקים מספר חידושים חשובים המספקים מודל מורין עם אמינות גבוהה, רבייה, ואובייקטיביות בחקר אנדומטריוזיס. הגישה שלנו מקדמת את התחום לא רק על ידי מתן תהליך פשוט ויעיל לגיוס נגעים, אלא גם דרך סטנדרטית של מדידה ודיווח של נתונים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.
Acknowledgments
ברצוננו להודות לחברי מעבדת רייס על סקירתם הביקורתית ותובנותיהם במהלך הכנת כתב היד, וכן לליבות ההדמיה וההיסתולוגיה במכון המחקר לרנר על עזרתם באיסוף נתונים וניתוח נתונים. עבודה זו נתמכה באמצעות מימון מענק פנימי באמצעות ועדת תוכנית המחקר בקליבלנד קליניק ועל ידי מענק חיצוני באמצעות האגודה לחקירת פוריות ובאייר. המחקר במעבדת Reizes ממומן גם באמצעות אופני VeloSano לריפוי, המרכז למצוינות מחקרית בסרטן גינקולוגי, ודרך הכיסא ניחן לורה ג 'פוגרטי לחקר סרטן הרחם. קליבלנד קליניק מחזיקה באישור זכויות היוצרים באיור 1 וב-איור 2.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Supplies for injecting PMSG into donor mouse | |||
| 1 mL Tuberculin syringe with 27G needle | Fisher Scientific | 14-826-87 | |
| Pregnant mare serum gonadotropin | Sigma-Aldrich | 9002-70-4 | |
| Supplies for necropsy of donor mouse and tissue processing | |||
| 6” serrated forceps, curved tip | Electron Microscopy Sciences | 72993-6C | |
| 70% ethanol solution | Pharmco | 33000HPLCCS4L | 70% solution dilute ethyl acetate 200 proof |
| Analytical balance | Mettler Toledo | ME54TE | |
| Carbon dioxide | TriGas Supplier | ||
| Dissecting tray | Fisher Scientific | S14000 | |
| No. 10 disposable scalpel | Fisher Scientific | NC9999403 | |
| Scissors, curved | Electron Microscopy Sciences | 72941 | |
| Scissors, straight | Electron Microscopy Sciences | 72940 | |
| Stereo microscope | Leica Microsystems | Leica SE 4 | For tissue dissection |
| Sterile phosphate buffered saline (PBS) | Institutional core facility supplies | ||
| Surgical instrument sterilization tray | Electron Microscopy Sciences | 66112-02 | |
| Tissue culture dishes | Fisher Scientific | 08-772E | |
| Weighing dishes | Fisher Scientific | 02-202-103 | |
| Supplies for injecting into recipient mouse | |||
| 1 cc syringe | BD Biosciences | 301025 | |
| 18 G needle | Fisher Scientific | 148265d | |
| 200 uL pipette tip | Fisher Scientific | 02-707-422 | |
| Double distilled water | Institutional core facility supplies | ||
| Latex bulb | Fisher Scientific | 03-448-21 | |
| Micro cover glass slip | VWR | 48366-067 | |
| Microscope slide | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Standard light microscope | Leica Microsystems | DM IL | For evaluating vaginal cytology smears |
| Supplies for harvesting tissue from recipient mouse | |||
| 10% Buffered formalin | Fisher Scientific | SF100-4 | |
| Biopsy foam pads | Fisher Scientific | 22-038-222 | |
| Precision Digital Calipers | Electron Microscopy Sciences | 62065-40 | |
| Processing/embedding cassettes | Fisher Scientific | 22-272416 |
References
- Zondervan, K. T., Becker, C. M., Missmer, S. A.
- Schwartz, K., Llarena, N. C., Rehmer, J. M., Richards, E. G., Falcone, T. The role of pharmacotherapy in the treatment of endometriosis across the lifespan. Expert Opinion on Pharmacotherapy. 21 (8), 893-903 (2020).
- Giudice, L. C.
- D'Hooghe, T. M., Debrock, S. Endometriosis, retrograde menstruation and peritoneal inflammation in women and in baboons. Human Reproduction Update. 8 (1), 84-88 (2002).
- Ahn, S. H., et al. Pathophysiology and immune dysfunction in endometriosis. BioMed Research International. 2015, (2015).
- Falcone, T., Flyckt, R.
- Vercellini, P., et al. Association between endometriosis stage, lesion type, patient characteristics and severity of pelvic pain symptoms: a multivariate analysis of over 1000 patients. Human Reproduction. 22 (1), 266-271 (2007).
- Bulun, S. E., et al.
- Brueggmann, D., et al. Novel three-dimensional in vitro models of ovarian endometriosis. Journal of Ovarian Research. 7, 17 (2014).
- Dodds, K. N., Beckett, E. A. H., Evans, S. F., Hutchinson, M. R. Lesion development is modulated by the natural estrous cycle and mouse strain in a minimally invasive model of endometriosis. Biology of Reproduction. 97 (6), 810-821 (2017).
- Martinez, J., Bisbal, V., Marin, N., Cano, A., Gómez, R. Noninvasive monitoring of lesion size in a heterologous mouse model of endometriosis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (144), (2019).
- Pelch, K. E., Sharpe-Timms, K. L., Nagel, S. C. Mouse model of surgically-induced endometriosis by auto-transplantation of uterine tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (59), e3396 (2012).
- Nishimoto-Kakiuchi, A., et al. Spontaneous endometriosis in cynomolgus monkeys as a clinically relevant experimental model. Human Reproduction. 33 (7), Oxford, England. 1228-1236 (2018).
- Nair, H. B., et al. An efficient model of human endometriosis by induced unopposed estrogenicity in baboons. Oncotarget. 7 (10), 10857-10869 (2016).
- Laganà, A. S., et al. Translational animal models for endometriosis research: a long and windy road. Annals of Translational Medicine. 6 (22), 431 (2018).
- Bellofiore, N., et al. First evidence of a menstruating rodent: the spiny mouse (Acomys cahirinus). Amercian Journal of Obstetrics and Gynecology. 216 (1), 1-11 (2017).
- Bruner-Tran, K. L., Mokshagundam, S., Herington, J. L., Ding, T., Osteen, K. G. Rodent models of experimental endometriosis: identifying mechanisms of disease and therapeutic targets. Current Women's Health Reviews. 14 (2), 173-188 (2018).
- Bilotas, M. A., et al. Interplay between endometriosis and pregnancy in a mouse model. PloS One. 10 (4), 0124900 (2015).
- Peterse, D., et al. Of mice and women: a laparoscopic mouse model for endometriosis. Journal of Minimally Invasive Gynecology. 25 (4), 578-579 (2018).
- Richards, E. G., et al. KLF11 is an epigenetic mediator of DRD2/dopaminergic signaling in endometriosis. Reproductive Sciences. 224 (8), Thousand Oaks, Calif. 1129-1138 (2017).
- Jones, R. L., Lang, S. A., Kendziorski, J. A., Greene, A. D., Burns, K. A. Use of a Mouse Model of Experimentally Induced Endometriosis to Evaluate and Compare the Effects of Bisphenol A and Bisphenol AF Exposure. Environmental Health Perspectives. 126 (12), 127004 (2018).
- Greaves, E., et al. A novel mouse model of endometriosis mimics human phenotype and reveals insights into the inflammatory contribution of shed endometrium. The American Journal of Pathology. 184 (7), 1930-1939 (2014).
- Nothnick, W. B., Graham, A., Holbert, J., Weiss, M. J. miR-451 deficiency is associated with altered endometrial fibrinogen alpha chain expression and reduced endometriotic implant establishment in an experimental mouse model. PloS One. 9 (6), 100336 (2014).
