이 연구는 절제 처리 중 망막 무결성을 손상시키는 것을 방지하는 새로운 인간 organotypic 망막 문화 (HORC) 모형을 개발하는 것을 목표로 합니다. 이것은 과대 유리체와 근본적인 망막 안료 상피 코로이드 (RPE-choroid) 및 clera로 망막을 배양해서 달성됩니다.
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방법 논문
소설 인간 오르가노피 망막 문화 기술의 특성화
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
이전 인간 organotypic 망막 문화 (HORC) 모델은 분리 된 망막을 활용; 그러나 망막 색소 상피-코로이드(RPE-choroid) 및 스클레라에 의해 부여된 구조적 지지없이 연약한 망막의 무결성은 쉽게 손상될 수 있다. 이 연구의 목적은 망막, RPE-choroid 및 clera가 함유 된 새로운 HORC 모델을 개발하여 망막 퇴치를 배양 할 때 망막 무결성을 유지하는 것이었습니다.
홍채와 렌즈를 제거하기 위해 림두를 따라 둘레로 절단 한 후, 4 개의 깊은 절개는 안컵을 평평하게하기 위해 만들어졌다. 이전 HORC 프로토콜과는 달리, 트레핀은 망막뿐만 아니라 RPE-choroid 및 clera를 통해 절단하는 데 사용되었다. 결과 삼중층 이절은 72시간 동안 배양되었다. 헤마톡시린과 에오신 염색(H&E)은 해부학적 구조와 망막 박출을 평가하는 데 사용되었고, 세포 무결성 및 망막 염증을 위한 면역 조직화학(IHC)을 더욱 특징으로 하였다. 질병 유도의 가능성을 확인하기 위해, 이질은 당뇨병 성 망막병증 (DR)을 모방하기 위해 높은 포도당 (HG) 및 프로 염증 성 사이토카인 (Cyt)에 노출되었다. 루미넥스 자기 비드 분석은 배양 배지로 방출된 DR 관련 사이토카인을 측정하는 데 사용되었습니다.
H&E 염색은 기본 RPE-choroid 및 clera와 망막 에 있는 뚜렷한 망막 라멜라 및 소형 핵을 드러내고, 근본적인 구조물이 없는 망막은 감소된 두께 및 가혹한 핵 손실을 나타내었다. IHC 결과는 세포 질과 망막 염증의 부재뿐만 아니라 보존 뮐러 세포 무결성을 나타냈다. Luminex assays는 24시간 기준수준에 비해 HG + Cyt에 노출된 망막 이식에서 DR-관련 프로 염증 성 사이토카인의 분비를 현저히 증가시켰습니다.
우리는 성공적으로 개발 하 고 망막 무결성 세포사멸 또는 망막 염증 없이 보존 하는 새로운 HORC 프로토콜을 특징으로. 더욱이, HG + Cyt에 망막 이질을 노출할 때 DR 관련 프로 염증성 바이오마커의 유도된 분비는 이 모형이 임상적으로 전도성 망막 질병 연구 결과에 사용될 수 있었다는 것을 건의합니다.
서론
망막은 들어오는 빛 에너지를 전기 신호로 변환하는 고도로 전문화된 안구 구조로, 이는 시각적 지각을 위해 뇌에 의해 처리됩니다. 인간 망막은 2개의 시냅스와 3개의 핵층1(도 1)으로 구성된 독특한 라멜라구조로 고도로 조직된 세포 모형의 다이나믹 범위를 포함합니다. 망막 항상성 신경 망막 세포 사이 복잡 한 연결에 의해 유지, 혈관, 신경, 결합 조직 및 RPE1. 정교한 망막 해부학 및 생리학으로 인해 많은 망막 질환의 메커니즘은 여전히2,3,4,5로제대로 이해되지 않습니다. 망막 질환을 더 잘 연구하기 위해 HORC 모델은6,7,8,9로개발되었습니다. 동물 연구 와 체 외 배양에 비해, HORC 모....
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프로토콜
인간 기증자 눈 컵은 이식을 위한 각막 절제에 따라 뉴질랜드 국립 안과 은행에서 얻었으며 북부 B 건강 및 장애 윤리위원회 (NTX/06/19/CPD/AM07)의 승인을 받았습니다.
참고: 배양은 멸균 조직 배양 조건을 보장하기 위해 Class II 생물 안전 캐비닛에서 수행해야 합니다. 조직은 상당한 망막 무결성 손실을 피하기 위해 24 시간 사후 평가 내에서 배양되어야합니다.
그림 2: 샌드위치 망막 내출기 의 절차를 보여주는 이미지. 절제 준비를 위해, 하나의 날카로운 팁과 하나의 무딘 끝으로 해부 가위를 사용, 무딘 끝은 절개 하는 동안 조직 손상을 줄이기 위해 세계의 내부를 향하고. 또한 무딘 끝이있는 집게를 사용하여 처리 중에 안구 조직을 긁는 것을 방지하십시오. 외과 가위를 사용하여, 무딘 끝이 내부를 향하고, 홍채와 렌즈(A-C)를제거하기 위해 림두스를 따....
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결과
망막 무결성은 이 HORC 모델에 보존되었습니다. 망막 무결성은 배양 샌드위치 망막 이분야에서 보존되었지만 인접한 구조물없이 배양된 망막에서 손실되었습니다. H&E는 문화에서 72시간 이후에 단면 샌드위치 망막 의 구조적 무결성을 검사하기 위해 실시되었습니다. 샌드위치 망막 이출은 INL 및 ONL(도 4A)에서컴팩트 한 핵을 가진 GCL에서 ONL에 대한 뚜렷한 라멜라 구조를 보존하는 무결성과 뚜렷한 라멜라 구조를 보였다. 그러나, 망막 무결성이 동일한 샘플의 가장자리에서 발견되었으며, 망막은 기본 RPE-choroid 및 clera로부터 분리되어 INL 및 ONL(그림4B)에서핵의 감소된 망막 두께 및 분리 손실을 나타냈다.
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토론
HORC는 현재 전임상 망막 연구에서 가장 임상적으로 번역 가능한 모델입니다. 시험관 내 세포 배양 모델에 비해, HORC는 동적 망막 세포 유형과 뉴런, 혈관 및 세포 외 환경과의 연결을 유지하여 그 자체에서 인간의 망막의 해부학을 더 잘 나타낼 수 있다19. 동물 모델에 비해 HORC는 동물모델(19)에서긍정적인 결과에도 불구하고 실패한 임상 시험에 기여할 수 있는 다양한 망막 세포 유형뿐만 아니라 다양한 광수용체 밀도 및 비율과 같은 종 간 변이로 인한 인간 망막 질환에 대한 약제학적 치료법을 연구하고 설계하는 데 더 유리하다. 그러나, 이전 HORC 프로토콜에서, 망막은 의도적으로 RPE-choroid 및 sclera에서 분리되었습니다. 터프 한 clera없이, 어설픈 망막은 처리하기 어렵고 망막 무결성은 직접 집게6,7,<.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
저자는 눈 조직의 관대 한 기부자와 뉴질랜드 국립 안과 은행의 팀에게 그들의 지원에 감사드립니다. 이 작품은 모리스와 필리스 페이켈 트러스트와 오클랜드 의학 연구 재단 (1117015)의 프로젝트 보조금에 의해 재정적으로 지원되었다. IDR의 이사직은 부캐넌 자선 재단의 지원을 받고 있습니다. CK의 장학금은 뉴질랜드 검안사 교육 연구 기금(CC36812)에서 제공하며, HHL의 장학금은 부캐넌 자선 재단에서 제공합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 일회용 생검 펀치 (5mm) | Integra York PA Inc., USA | 21909-142 | 이 기사에서는 외과용 트레핀 이라고 함 |
| 인간 재조합 IL-1β | Peprotech, 미국 | 200-01B | 작업 농도: 10 ng/mL |
| 인간 재조합 TNF-a | Peprotech, 미국 | 300-01A | 작업 농도: 10 ng/mL |
| DAPI (1 µ g/mL) | Sigma Aldrich, 독일 | #D9542 | 핵 얼룩. 작동 희석 1:1000 |
| DMEM/F-12, GlutaMAX supplement | Gibco, Thermofisher, Scientific Inc., USA | 10565018 | Dulbecco' s Modified Eagle 배지 영양 혼합물 F-12는 1×를 함유합니다. 항생제와 항진균제 혼합물 (AA, 100× stock) |
| Fine Scissors - Sharp-Blunt | Fine Science Tools (F.S.T) | 14028-10 | 팁: Sharp-Blunt, 절삭날: 27mm, 길이: 10cm, 합금/재질: 스테인리스강, 톱니 모양: 아니오, 팁 모양: Straight |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools (F.S.T) | 11050-10 | 길이:10cm, 팁 모양: 스트레이트, 팁: 톱니형, 팁 너비: 0.8mm, 팁 치수:0.8 x 0.7mm, 합금/재질: 스테인리스 스틸 |
| 마우스 단클론 GFAP-Cy3 | Sigma Aldrich, 독일 | #C9205 | Cy3에 접합된 1차 항체. 작동 희석 1:1000. |
| 마우스 단클론 Vimentin-Cy3 | Sigma Aldrich, 독일 | #C9080 | Cy3에 접합된 1차 항체. 작업 희석 1:50. |
| 토끼 다클론 TUNEL (In situ cell death Detection Kit, Fluorescein) | Sigma Aldrich, Germany | #11684795910 | Fluorescein-dUTP에 접합된 1차 항체. 효소 완충액을 가진 작동 희석 1:10. |
참고문헌
- Kolb, H., Fernandez, E., Nelson, R. Facts and Figures Concerning the Human Retina. Webvision-The Organization of the Retina and Visual System. , Internet (2005).
- Gemenetzi, M., De Salvo, G., Lotery, A. Central serous chorioretinopathy: an update on pathogenesis and treatment.<....
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