פרוטוקול זה מציג מודל ניסיוני חדשני של תרבות איברי שור פרו-פלמטורית ומנוונת כדי לדמות ניוון דיסק בין חולייתי בשלב מוקדם.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
מודל תרבות איברים ניוונית Proinflammatory כדי לדמות מחלת דיסק בין חולייתי בשלב מוקדם.
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
ניוון דיסק בין חולייתי סימפטומטי (IVD) (IDD) הוא נטל חברתי-כלכלי גדול ומאופיין בדלקת והשפלת רקמות. בשל היעדר טיפולים סיבתיים, יש צורך דחוף במודלים חדשניים של תרבות איברים ניסיונית כדי לחקור את המנגנונים המעורבים בהתקדמות המחלה, למצוא מטרות טיפוליות ולהפחית את הצורך במודלים של בעלי חיים. אנו מציגים כאן פרוטוקול מודל תרבות איברים תלת מימדי חדשני המחקה את המיקרו-ווירון הפרו-פלמטורי והקטבולי, שקיים במהלך IDD.
בתחילה, עירויים של שור נותחו, נוקו ותרביתו במדיום תרבית הרקמות. טעינה פיזיולוגית או פתולוגית דינמית הוחלה בביוריאקטור בהתאמה אישית במשך שעתיים ביום. IVDs הוקצו לקבוצת ביקורת (מדיום גלוקוז גבוה, טעינה פיזיולוגית, הזרקת מלח אגירה פוספט) וקבוצה פתולוגית (בינוני גלוקוז נמוך, טעינה פתולוגית, נמק הגידול גורם אלפא הזרקה) במשך ארבעה ימים. ניתוח ביטוי גנים מתאי פולפוסוס גרעין שנאספו של IVDs ואנליזה אימונוסורבנטית הקשורה לאנזימים של מדיית תרבות האיברים הממוזגת בוצעה.
הנתונים שלנו חשפו ביטוי גבוה יותר של סמנים דלקתיים וגובה דיסק מופחת לאחר טעינה בקבוצה הפתולוגית בהשוואה לקבוצת הביקורת. פרוטוקול זה אמין כדי לדמות דלקת IVD ניוון והוא יכול להיות מורחב עוד יותר כדי להרחיב את היקף היישום שלה.
מבוא
כאבי גב תחתון (LBP) יכולים להשפיע על אנשים בכל הגילאים והוא גורם מוביל לנכות ברחבי העולם1,2,3. העלות הכוללת המשויכת LBP עולה $100 מיליארד דולר בשנה4,5. ניוון דיסק בין חולייתי סימפטומטי (IVD) (IDD), מצב המאופיין בדלקת והשפלת רקמות, הוא הגורם העיקרי של LBP6,7. באופן ספציפי, IDD מאופיין על ידי פירוק מתפתח בהדרגה של המטריצה החוץ תאית של IVD (ECM), המושרה ומופעל על ידי גורמים מרובים שמובילים פתולוגיה מואצת, הפרעות נוירולוגיות, ובסופו של דבר נכות. יתר על כן, IDD קשו....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
ניסויים בוצעו באמצעות זנבות שור שהתקבלו מבתי מטבחיים מקומיים. החומרים הביולוגיים המשמשים במחקר הנוכחי נלקחים משרשרת המזון ואינם דורשים אישור אתי בחוק השוויצרי והאירופי.
1. ניתוח של הדיסק הבין חולייתי בקר
- יש לשטוף את כל הזנב ביסודיות במי ברז כדי להסיר לכלוך ושיער על פני השטח.
הערה: עם קצוות דיסטליים שלמים, ניתן להשתמש לכל היותר ב- 9 דיסקים IVD (עצם הזנב 1-9) לכל זנב לניסויים בהתאם לגודל הרצוי של ההפריה החוץ-גופית. בהתחשב בקוטר הרצוי בין 15-20 מ"מ, השתמשנו 12 זנבות שור עם 5 IVDs לכל זנב לניסויים. - לטבול את הזנב כולו בתיבה המכילה 1% פתרון betadine במשך 10 דקות. לייבש לזמן קצר את הזנב עם גזה סטרילית ומניחים אותו על וילון ס....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
טעינה ניוונית במדיום גלוקוז נמוך בשילוב עם הזרקת TNF-α גרמו לעלייה משמעותית בביטוי הגנים של סמנים פרו-פלמולמטיים אינטרלוקין 6 (IL-6) ואינטרלוקין 8 (IL-8) בהשוואה לקבוצת הביקורת הפיזיולוגית בתאי NP לאחר 4 ימי תרבות (איור 2). לעומת זאת, לא ראינו שינויים משמעותיים עבור הגנים הפרוינפלמטוריים אינטרלוקין 1β (IL-1β) ו- TNF-α בתאי NP (נתונים שאינם מוצגים). יתר על כן, תנאי תרבות ניוונית לא שינו את ביטוי הגנים של IL-6 ו IL-8 בתאי AF.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
סיפקנו כאן פרוטוקול מפורט כדי לדמות IVDD ניווני ודלקתי. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם עבור בדיקות מפורטות של מסלולים דלקתיים המובילים להשפעות ההרסניות על הדיסק. יתר על כן, הפרוטוקול יכול לעזור לקבוע מטרות טיפוליות מבטיחות המעורבות בהתקדמות המחלה.
לאחרונה הראינו כי TNF-α רקומביננטי אנושי יכול לגרום לדלקת הן בתאי שור והן בתאי NP אנושיים21, וזה בהתאם למחקרים אחרים בתחום המאשרים כי TNF-α יכול לשמש לסימולציה דלקת בתאי IVD22,
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי קרן AO ו- AOSpine הבינלאומי. באבאק סראבי זכה לתמיכת מלגות מקרן עמוד השדרה הגרמנית וקרן דלקת מפרקים ניוונית גרמנית. גרנוט לאנג נתמך על ידי תוכנית ברטה-אוטנשטיין למדענים קליניים מתקדמים, הפקולטה לרפואה, אוניברסיטת פרייבורג, גרמניה.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 1-Bromo-3-chloropropane(BCP) | Sigma-Aldrich, סנט לואיס, ארה"ב | B9673 | |
| Ascorbate-2-phosphate | Sigma-Aldrich, סנט לואיס, ארה"ב | A8960 | |
| מסור פס | Exakt Apparatebau, נורדרשטדט, גרמניה | דגם 30/833 | |
| Betadine | Munndipharma, פרנקפורט, גרמניה | ||
| בקר IL-8 עשה זאת בעצמך ELISA | Kingfisher Biotech, סנט פול, ארה"ב | DIY1028B-003 | |
| Corning ITS Premix | Corning Inc., ניו יורק, ארה"ב | 354350 | |
| DMEM High Glucose | Gibco by Life Technologies, קרלסבד, ארה"ב | 10741574 | |
| DMEM Low Glucose | Gibco by Life Technologies, קרלסבד, ארה"ב | 11564446 | |
| אתנול לביולוגיה מולקולרית | סיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, ארה"ב | 09-0851 | |
| סרום בקר עוברי (FBS) | Gibco by life technologies, קרלסבד, ארה"ב | A4766801 | |
| תמיסת חומצות אמינו לא חיוניות | Gibco by life technologies, קרלסבד, ארה"ב | 11140050 | |
| פניצילין/סטרפטומיצין (P/S) | gibco by life technologies, קרלסבד, ארה"ב | 11548876 | |
| תמיסת חיץ פוספט, טבליה | Sigma-Aldrich, סנט לואיס, ארה"ב | P4417 | |
| Pronase | Sigma-Aldrich, סנט לואיס, ארה"ב | 10165921001 | |
| Primocin | InvivoGen, Sandiego, ארה"ב | ant-pm-05 | |
| Pulsavac Jet Lavage System | Zimmer, IN, USA | ||
| TissueLyser II | Quiagen, Venlo, הולנד | 85300 | |
| Streptavidinn-HRP | Kingfisher Biotech, סנט פול, ארה"ב | AR0068-001 | |
| Superscript VILO | Invitrogen by life Technologies, קרלסבד, ארה"ב | ערכת | |
| cDNA | ביו-מערכות יישומיות על ידי טכנולוגיות חיים | 10400745 | |
| TaqMan Universal Master Mix | Applied Biosystems by life technologies | ||
| TNF-alpha, חלבון אנושי רקומביננטי | R& D systems, מינסוטה, ארה"ב | 210-TA-005 | |
| מרכז המחקר המולקולרי TRI Reagent, סינסינטי, ארה"ב | TR 118 | ||
| Tris-EDTA פתרון חיץ | סיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, ארה"ב | 93283 | |
| Gene bIL-6 | Applied Biosystems by life technologies | בדיקות | בהתאמה אישיתפריימר fw (5′ – 3&פריים;) TTC CAA AAA TGG AGG AAA AGG A פריימר rev (5′ – 3&פריים;) TCC AGA AGA CCA GCA GTG GTT בדיקה (5′ FAM/3′ TAMRA) CTT CCA ATC TGG GTT CAA TCA GGC GATT |
| Gene bIL8 | Applied Biosystems by Life Technologies | Bt03211906_m1 | |
| Gene bTNF-alpha | Applied Biosystems by life technologies בדיקות | בהתאמה אישית | Primer fw (5′ – 3&פריים;) CCT CTC AAG CCT CAA GTA ACA A פריימר rev (5′ – 3&פריים;) GAG CTG CCC CGG AGA GTT בדיקה (5′ FAM/3′ TAMRA) ATG TCG GCT ACA ACG TGG GCT ACC G |
| GENE bIL1beta | Applied Biosystems by Life Technologies | בדיקות בהתאמה אישית | Primer fw (5′ – 3&פריים;) TTA CTA CAG TGA CGA GAA TGA GCT GTT פריימר rev (5′ – 3&פריים;) GGT CCA GGT GTT GGA TGC A בדיקה (5′ FAM/3′ TAMRA) CTC TTC ATC TGT TTA GGG TCA TCA GCC TCA A |
| RPLP0 | Applied Biosystems by Life Technologies | Bt03218086_m1 |
מקורות
- Vos, T., et al. Global, regional, and national incidence, prevalence, and years lived with disability for 328 diseases and injuries for 195 countries, 1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. The Lancet. 390 (10100), 1211-1259 (2017).
- Hoy, D., et al.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
