يوضح هذا البروتوكول نظام تعتيم البروتين المستحث كيميائيا لإنشاء المكثفات على الكروماتين. يتم إظهار تشكيل الجسم النووي لسرطان الدم البروميلوسيتيكي (PML) على التيلوميرات ذات الخافضات الكيميائية. يتم رصد نمو القطيرات وانحلالها وتوطينها وتكوينها من خلال تصوير الخلايا الحية والفلورة المناعية (IF) والفلورة في التهجين الموقعي (FISH).
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
المكثفات البروتينية الناجمة عن الديميرات الكيميائية على التيلوميرات
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
والمكثفات المرتبطة بالكروماتين متورطة في العديد من العمليات النووية، ولكن الآليات الأساسية لا تزال بعيدة المنال. يصف هذا البروتوكول نظام تضفير البروتين الناجم عن المواد الكيميائية لإنشاء المكثفات على التيلوميرات. ويتكون المخمل الكيميائي من اثنين من الليغندات المرتبطة التي يمكن أن يرتبط كل منها بالبروتين: هالو ليغند إلى هالو إنزيم وتريمثوبريم (TMP) إلى إعادة الاختزال الإشريكية القولونية (eDHFR)، على التوالي. الانصهار من إنزيم هالو إلى بروتين التيلومير المراسي ديميرز إلى التيلوميرات من خلال التعادل هالو ليغاند إنزيم ملزمة. ربط TMP إلى eDHFR المجندين eDHFR تنصهر المرحلة فصل البروتينات إلى التيلوميرات ويحفز تشكيل المكثفات. لأن TMP-eDHFR التفاعل غير التكافؤ، يمكن عكس التكثيف باستخدام TMP الحرة الزائدة للتنافس مع جهاز التعتيم لربط eDHFR. ويظهر مثال على تحفيز سرطان الدم النووي (PML) تشكيل الجسم النووي على التيلوميرات وتحديد نمو المكثفات، وانحلال، والتوطين وتكوينها. يمكن تكييف هذه الطريقة بسهولة للحث على المكثفات في مواقع الجينوم الأخرى عن طريق دمج هالو إلى بروتين يرتبط مباشرة بالكروماتين المحلي أو dCas9 الذي يستهدف الموضع الجينومي مع الحمض النووي الريبي الإرشادي. من خلال تقديم الدقة الزمنية المطلوبة للتصوير الحي للخلية الواحدة مع الحفاظ على فصل المرحلة في مجموعة من الخلايا لإجراء المقايسات الكيميائية الحيوية ، فإن هذه الطريقة مناسبة للتحقيق في كل من تكوين ووظيفة المكثفات المرتبطة بالكروماتين.
المقدمة
تخضع العديد من البروتينات والأحماض النووية لفصل المرحلة السائلة السائلة (LLPS) والتجمع الذاتي في المكثفات الجزيئية الحيوية لتنظيم الكيمياء الحيوية في الخلايا1،2. LLPS من البروتينات الكروماتين ملزمة يؤدي إلى تشكيل المكثفات التي ترتبط مع loci الجينوم محددة وتورطت في مختلف وظائف الكروماتين المحلية3. على سبيل المثال، LLPS من بروتين HP1 يكمن وراء تشكيل مجالات heterochromatin لتنظيم الجينوم4،5، LLPS من عوامل النسخ تشكل مراكز النسخ لتنظيم النسخ6، LLPS من mRNAs الوليدة والبروتين أمشاط متعددة الجنس يولد أجسام مكان....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. إنتاج خطوط الخلايا العابرة
- ثقافة U2OS الخلايا المقبولة على 22 × 22 مم الزجاج coverslips (للتصوير الحي) أو 12 مم قطرها الأغطية الدائرية (لIF أو FISH) المغلفة بولي مد ليسين في لوحة 6-جيدا مع متوسط النمو (10٪ مصل البقر الجنين و 1٪ محلول البنسلين-ستريبتومايسين في DMEM) حتى تصل إلى 60-70٪ التقاء.
- استبدال متوسط النمو مع متوسطة 1 مل transfection (متوسط النمو دون محلول البنسلين-ستريبتومايسين) قبل transfection.
- لكل بئر من أجهزة العدوى، أضف 4 ميكرولتر من كاشف العدوى إلى 150 ميكرولتر من وسائط المصل المخفضة، ودوامة لمدة 10 ثوان ثم احتضان لمدة 5 دقائق.
- لكل بئر، إضافة هالو بناء البلازميد (هالو-GFP-TRF1 أو هالو-TRF1) وeDHFR....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
وتظهر الصور التمثيلية لتوطين السومو التي حددها التيلومير DNA FISH وبروتين السومو IF في الشكل 2. الخلايا مع تجنيد SIM أثرت SUMO1 و SUMO 2/3 على التيلوميرات مقارنة مع الخلايا مع تجنيد متحولة SIM. وهذا يشير إلى أن إثراء السومو الناجم عن تعتيم SIM على التيلوميرات يعتمد على تفاعلات SUMO-SIM.
يتم عرض فيلم الفاصل الزمني التمثيلي ل TRF1 وSIM بعد التعتيم في الفيديو 1. تظهر اللقطات في أربع نقاط زمنية في الشكل 3A. تم توظيف SIM ب.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
أظهر هذا البروتوكول تشكيل وانحلال المكثفات على التيلوميرات بنظام التعتيم الكيميائي. يتم رصد الحركية من فصل المرحلة والتيلومير الناجم عن الانصهار القطيرات التجمع مع التصوير الحي. يتم تحديد توطين المكثفات وتكوينها مع الحمض النووي السمك والبروتين IF.
هناك خطوتان حاسمتان في هذا البروتوكول. الأول هو تحديد تركيز البروتين والخافق. يعتمد النجاح في تحفيز فصل المرحلة المحلية في مكان الجينوم على زيادة التركيز المحلي للمرحلة التي تفصل البروتين فوق التركيز الحرج لفصل المرحلة (الشكل 1ب<.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.
شكر وتقدير
تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة في الولايات المتحدة (1K22CA23763201 إلى H.Z. و GM118510 إلى D.M.C)ومؤسسة تشارلز كوفمان إلى H.Z. ويود المؤلفون أن يشكروا جيسون تونز على التدقيق في المخطوطة.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 0.25٪ تربسين ، 0.1٪ EDTA في HBSS بدون الكالسيوم والمغنيسيوم وبيكربونات الصوديوم | كورنينج | MT25053CI | |
| 16٪ فورمالديهايد (وزن / حجم) ، خال من الميثانول | Thermo Scientific | 28906 | تحضير 1٪ في 1x PBS |
| 6 لوحة ثقافة الآبار | VWR | 10861-554 | |
| رقائق الألومنيوم | فيشر Scientific | 01-213-101 | |
| الأجسام المضادة ل mCherry | Abcam | Ab183628 | |
| الأجسام المضادة ل PML | سانتا كروز | sc966 | |
| الأجسام المضادة المضادة ل SUMO1 | Abcam | Ab32058 | |
| الأجسام المضادة | للهيكل الخلوي | ASM23 | |
| كاشف حجب | Roche | 11096176001 | |
| ألبومين مصل الأبقار (BSA) | فيشر BP9706100 | ||
| BTX أنبوب مايكرو 1.5ML | VWR | 89511-258 | |
| غطاء دائري | Thermo Scientific | 3350 | |
| مجهر متحد البؤر | نيكون | MQS31000 | |
| DAPI | فيشر العلمي | D1306 | |
| ثنائي ميثيل سلفوكسيد ؛ | سيجما ألدريتش | 472301 | |
| DMEM مع L-Glutamine و 4.5g / L من الجلوكوز وبيروفات الصوديوم | Corning | MT10017CV | |
| كاميرا EMCCD | iXon Life & nbsp ؛ | 897 | |
| الإيثانول | |||
| فيشر العلمي ، مؤهل ومعتمد من وزارة الزراعة الأمريكية مناطق | Gibco | A4766801 | |
| فورماميد ، منزوع الأيونات | MilliporeSigma | 46-101-00ML | |
| الماعز المضاد للفأر IgG (H + L) ، الجسم المضاد الثانوي المؤتلف ، Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A28181 | |
| الماعز المضادة للأرانب IgG (H + L) ، الجسم المضاد الثانوي المؤتلف ، Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A32733 | |
| ملاقط عالية الدقة مدبب فائق الدقة / ملقط | فيشر Scientific | 12-000-122 | |
| وحدة دمج الليزر ؛ | نيكون | NIIMHF47180 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Gibco | 21083027 | |
| Lipofectamine 2000 كاشف الإرسال | Invitrogen | 11668027 | |
| برنامج رسم الشكل ، MATLAB | The MathWorks | ||
| Microscope Slide Box | Fisher Scientific | 34487 | |
| طلاء الأظافر | فيشر العلمي | 50-949-071 | |
| برنامج التصوير, NIS-Elements | نيكون | ||
| أوبتي-ميم سيروم ميزيتل ميديا | جيبكو | 51985091 | |
| بارافيلم | بيميس | 13-374-12 | |
| PBS 10x ، درجة الحموضة 7.4 | فيشر ساينتفيك | 70-011-044 | |
| محلول البنسلين الستربتومايسين ، 100X | Gibco | 15140122 | |
| Piezo Z-Drive ؛ | Physik Instrumente (PI) | 91985 | |
| Pipet Tips | VWR | 10017 | |
| شرائح مجهر زاوية مقصوصة عادي وبلوري | فيشر ساينتفيك | 22-037-246 | |
| محلول بولي دي ليسين | سيجما ألدريتش | A-003-E | |
| الصوديوم أزيد | فيشر Scientific | BP922I-500 | |
| قرص الغزل | يوكوجاوا | CSU-X1 | |
| غطاء مربع زلات | Thermo Scientific | 3305 | |
| TBS 10x حل | فيشر Scientific | BP2471500 | |
| TelC-Alexa488 | PNA Bio | F1004 | |
| TMP | تم تصنيعه بواسطة مختبر | متوفر عند الطلب | |
| TNH | تم تصنيعه بواسطة مختبر | متاح عند الطلب | |
| Tris Solution | Fisher Scientific | 92-901-00ML | |
| Triton X-100 10٪ Solution | MilliporeSigma | 64-846-350ML | تحضير 0.5٪ في 1x PBS |
| U2Os خط الخلايا | من مختبر E.V. Makayev (جامعة نانيانغ التكنولوجية ، سنغافورة) | HTB-96 | |
| VECTASHIELD مضاد للتلاشي تصاعد مختبرات ناقلات متوسطة | NC9524612 |
المراجع
- Shin, Y., Brangwynne, C. P. Liquid phase condensation in cell physiology and disease. Science. 357 (6357), (2017).
- Banani, S. F., Lee, H. O., Hyman, A. A., Rosen, M. K. Biomolecular condensates: organizers of cellular biochemistry. Nature Reviews Molecular Cell Biology<....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
