Этот протокол иллюстрирует химически индуцированную систему димеризации белка для создания конденсатов на хроматине. Показано образование ядерного тела промиелоцитарного лейкоза (ПМЛ) на теломерах с химическими димеризаторами. Рост, растворение, локализацию и состав капель контролируются с помощью визуализации живых клеток, иммунофлуоресценции (IF) и флуоресцентной гибридизации in situ (FISH).
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Химические белковые конденсаты, индуцированные димеризацией, на теломерах
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Хроматин-ассоциированные конденсаты участвуют во многих ядерных процессах, но лежащие в их основе механизмы остаются неуловимыми. Этот протокол описывает химически индуцированную систему димеризации белка для создания конденсатов на теломерах. Химический димеризатор состоит из двух связанных лигандов, каждый из которых может связываться с белком: галолиганд с гало-ферментом и триметоприм (TMP) с дигидрофолатредуктазой E. coli (eDHFR), соответственно. Слияние фермента Halo с теломерным белком прикрепляет димеризаторы к теломерам посредством ковалентного связывания Halo лиганд-фермент. Связывание TMP с eDHFR рекрутирует eDHFR-плавленую фазу, разделяющую белки на теломеры, и индуцирует образование конденсата. Поскольку взаимодействие TMP-eDHFR является нековалентным, конденсацию можно обратить вспять, используя избыточный свободный TMP, чтобы конкурировать с димеризатором за связывание eDHFR. Приведен пример индуцирования образования ядерного тела промиелоцитарного лейкоза (ПМЛ) на теломерах и определения роста, растворения, локализации и состава конденсата. Этот метод может быть легко адаптирован для индуцирования конденсатов в других геномных местах путем слияния Halo с белком, который непосредственно связывается с местным хроматином или с dCas9, который нацелен на геномный локус с направляющей РНК. Предлагая временное разрешение, необходимое для визуализации одиночных клеток в реальном времени, сохраняя при этом разделение фаз в популяции клеток для биохимических анализов, этот метод подходит для исследования как образования, так и функции конденсатов, связанных с хроматином.
Введение
Многие белки и нуклеиновые кислоты подвергаются разделению жидкой фазы (LLPS) и самособираются в биомолекулярные конденсаты для организации биохимии в клетках1,2. LLPS хроматинсвязывающих белков приводит к образованию конденсатов, которые связаны со специфическими геномными локусами и участвуют в различных функциях местного хроматина3. Например, ТОО белка HP1 лежит в основе формирования гетерохроматиновых доменов для организации генома4,5,ТООО факторов транскрипции формирует транскрипционные центры для регулирования транскрипции....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Производство переходных клеточных линий
- Культивируемые акцепторные клетки U2OS на стеклянные крышки диаметром 22 х 22 мм (для живой визуализации) или круглые покровные пластинки диаметром 12 мм (для ПЧ или FISH), покрытые поли-D-листином в 6-й колодце со средой роста (10% фетальная бычья сыворотка и 1% раствор пенициллин-стрептомицин в ДМЭМ) до тех пор, пока они не достигнут 60-70% конфюлюзии.
- Перед трансфекцией заменить питательную среду трансфекцией 1 мл (питательную среду без раствора пенициллина-стрептомицина).
- Для каждой трансфекционной скважины добавляют 4 мкл трансфекционного реагента к 150 мкл восстановленной с....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Репрезентативные изображения теломерной локализации SUMO, идентифицированные теломерной ДНК FISH и белка SUMO IF, показаны на рисунке 2. Клетки с набором SIM-карты обогащали SUMO1 и SUMO 2/3 на теломерах по сравнению с клетками с набором мутантов SIM. Это указывает на то, что вызванное димеризацией SIM обогащение SUMO на теломерах зависит от взаимодействий SUMO-SIM.
Репрезентативный покадровой ролик TRF1 и SIM-карты после димеризации показан в видео 1.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Этот протокол продемонстрировал образование и растворение конденсатов на теломерах с помощью системы химической димеризации. Кинетика разделения фаз и кластеризация теломер, вызванная слиянием капель, контролируются с помощью живой визуализации. Локализацию и состав конденсата определяют с помощью ДНК FISH и белка IF.
В этом протоколе есть два важных шага. Первый заключается в определении концентрации белка и димеризатора. Успех в индуцировании локального разделения фаз в геномном локусе завис.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Эта работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения США (1K22CA23763201 до H.Z., GM118510 до D.M.C.) и Фондом Чарльза Э. Кауфмана для H.Z. Авторы хотели бы поблагодарить Джейсона Тонса за корректуру рукописи.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 0,25% трипсина, 0,1% ЭДТА в HBSS без кальция, магния и бикарбоната | Corning | MT25053CI | |
| 16% формальдегида (w/v), без метанола | Thermo Scientific | 28906 | Приготовить 1% в 1x PBS |
| 6 Культуральная пластина | VWR | 10861-554 | |
| Алюминиевая фольга | Fisher Scientific | 01-213-101 | |
| Антитела против mCherry | Abcam | Ab183628 | |
| Антитело Anti-PML | Santa Cruz | sc966 | |
| Антитело Anti-SUMO1 | Abcam | Ab32058 | |
| Антитело Anti-SUMO2/3 | Цитоскелет | Asm23 | |
| Блокирующий реагент | Roche | 11096176001 | |
| Сыворотка крови крупного рогатого скота Альбумин (BSA) | Научный | BP9706100 | |
| BTX Tube micro 1.5ML | VWR | 89511-258 | |
| Круглая крышка | Thermo Scientific | 3350 | |
| Конфокальный микроскоп | Nikon | MQS31000 | |
| DAPI | Fisher Scientific | D1306 | |
| диметилсульфоксид | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| DMEM с L-глутамином, 4,5 г/л глюкозы и пирувата натрия | Corning | MT10017CV | |
| камерой EMCCD | iXon Life | 897 | |
| Этанол | Fisher Scientific | 4355221 | |
| Фетальная сыворотка крупного рогатого скота, сертифицированная, одобренная Министерством сельского хозяйства США регионы | Gibco | A4766801 | |
| формамид, деионизированный | MilliporeSigma | 46-101-00ML | |
| козий антимышиный IgG (H+L), рекомбинантное вторичное антитело, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A28181 | |
| Козий антикроличий IgG (H+L), рекомбинантное вторичное антитело, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A32733 | |
| Высокоточный прямой конический ультратонкий пинцет/щипцы | Fisher Scientific | 12-000-122 | |
| Модуль лазерного слияния | Nikon | NIIMHF47180 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Gibco | 21083027 | |
| Lipofectamine 2000 Реагент для трансфекции | Invitrogen | 11668027 | |
| Программное обеспечение для рисования рисунков, MATLAB | Микроскоп MathWorks | ||
| Слайд-бокс | Fisher Scientific | 34487 | |
| Лак для ногтей | Fisher Scientific | 50-949-071 | |
| Программное обеспечение для обработки изображений, NIS-Elements | Nikon | ||
| Opti-MEM Пониженная сыворотка Медиа | Gibco | 51985091 | |
| Парапленка | Bemis | 13-374-12 | |
| PBS 10X, pH 7,4 | Fisher Scientific | 70-011-044 | |
| Раствор пенициллина-стрептомицина, 100X | Gibco | 15140122 | |
| Piezo Z-Drive; | Physik Instrumente (PI) | 91985 | |
| Наконечники для пипеток | VWR | 10017 | |
| Предметные стекла для микроскопа с обрезанным углом | Fisher Scientific | 22-037-246 | |
| Раствор поли-D-лизина | Sigma-Aldrich | A-003-E | |
| Азид натрия | Fisher Scientific | BP922I-500 | |
| Вращающийся диск | Yokogawa | CSU-X1 | |
| Квадратная крышка | Thermo Scientific | 3305 | |
| TBS 10x раствор | Fisher Scientific | BP2471500 | |
| TelC-Alexa488 | PNA Bio | F1004 | |
| TMP | Синтезировано лабораторией | Доступно по запросу | |
| TNH | Синтезировано лабораторией | Доступно по запросу | |
| Tris Solution | Fisher Scientific | 92-901-00ML | |
| Triton X-100 10% раствор | MilliporeSigma | 64-846-350ML | Приготовьте 0,5% в 1x |
| PBS U2Os клеточной линии | из лаборатории Е.В. Макаева (Наньянский технологический университет, Сингапур) | HTB-96 | |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | NC9524612 |
Ссылки
- Shin, Y., Brangwynne, C. P. Liquid phase condensation in cell physiology and disease. Science. 357 (6357), (2017).
- Banani, S. F., Lee, H. O., Hyman, A. A., Rosen, M. K. Biomolecular condensates: organizers of cellular biochemistry. Nature Reviews Molecular Cell Biology<....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
