Method Article

ホスファチジルセリン/ホスファチジルイノシトール4-膜間のリン酸交換の蛍光ベースの測定

DOI:

10.3791/62177

⸱

March 14th, 2021

 ,  ,  , 
1Université Côte d’Azur, Centre National de la Recherche Scientifique, Institut de Pharmacologie Moléculaire et Cellulaire

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ここでは、蛍光脂質センサーおよびリポソームを用いて、タンパク質抽出物を用いてホスファチジルセリンまたはホスファチジルイノシトール4-リン酸 をインビトロで輸送するかを決定するプロトコルについて説明する。

Abstract

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進化的に保存されたオキシステロール結合タンパク質(OSBP)関連タンパク質(ORP)/OSBPホモログ(Osh)ファミリーのいくつかのメンバーは、最近、酵母およびヒト細胞における新しい脂質移動タンパク質(LTP)群を表していることが判明した。ホスファチジルセリン(PS)をPS/ホスファチジルイノシトール4リン酸(PI)交換サイクル を介して 、小胞子(ER)から形質膜(PM)に移します。この知見により、シグナル伝達プロセスに重要なPSがどのように細胞全体に分布しているか、およびこのプロセスとホスホイノシチド(PIP)代謝との間のリンクの調査がより深く理解できる。新しい蛍光ベースのプロトコルの開発は、この新しい細胞機構の発見と特徴付け に 役立っています。本論文では、タンパク質がPSまたはPI(4)Pを抽出し、人工膜間で脂質を移動させる能力を測定するための、蛍光標識された2つの脂質センサNBD-C2ラクト およびNBD-PHFAPPの製造と使用について説明する。まず、プロトコルは、これら2つの構成体の高純度サンプルを製造、ラベル付け、取得する方法を記述する。第2に、これらのセンサーを蛍光マイクロプレートリーダーと併用して、タンパク質がPsまたはPI(4)Pをリポソームから抽出できるかどうかを判断する方法を、Osh6pをケーススタディとして使用する方法を説明する。最後に、このプロトコルは、定義された脂質組成のリポソーム間のPS/PI(4)P交換の運動量を正確に測定し、標準蛍光計を用いた蛍光共鳴エネルギー伝達(FRET)による脂質移動率を測定する方法を示す。

Introduction

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異なる膜間および真核細胞1,2の膜内での脂質の正確な分布は、深い生物学的意味を有する。LTPsの機能の解読は、細胞生物学3、4、5、6、およびinvitroアプローチにおいて重要な問題であり、この問題7、8、9、10、11に対処する上で大きな価値がある。ここでは、細胞膜12間の複数のORP/Oshタンパク質がPS/PI(4)Pに影響を及ぼし、それによって新しいクラスのLTPsを構成することを確立するのに役立ったinvitro、蛍光ベースの....

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Protocol

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1. NBD-C2ラクトの精製

注:このプロトコルは、細菌を破壊する細胞破壊器の使用を詳述していますが、他のライシス戦略(例えばフランス のプレス)を使用するように変更することができます。精製の開始時に、システインの酸化を防ぐために、新たに脱気し、濾過し、2 mMジチオトライトール(DTT)を補充したバッファーを使用することが必須です。しかし、タンパク質ラベリングステップでは、DTTを完全に除去することが重要です。タンパク質の分解を避けるために、多くのステップを氷の上または冷たい部屋で行う必要があります。30 μLのサンプルは、15%アクリルアミドゲルを使用して、精製の進捗状況を確認するために、ドデシルスルフェート-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)の分析を行うために、プロトコルの異なるステップで収集する必要があります。各アリコートと十分な変性レムリサンプルバッファーを混合し、95°Cで混合物を加熱します。 チューブを凍結し、分析するまで-20 °Cで保管してください。

  1. 大腸菌におけるGST-C2ラクトの発現
    1. BL21ゴールドのコンピテントセルを20μL、殺菌水18μLと混合します。次いで、pGEX-C2ラクト プラスミド2μL(約65ng/μL)を細菌と混合し、エレクトロポレーションで変換します。150 μLのオートク....

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Results

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figure-results-1
図1: 蛍光脂質センサとインビトロアッセイの説明(A) ウシラクタジンのC2ドメインの結晶構造に基づくNBD-C2ラクトおよびNBD-PHFAPPの3次元モデル(PDB ID: 3BN648)およびヒトFAPP1タンパク質のPHドメインのNMR構造(PDB ID:2KJ46)N,N'-ジメチル-N-(チオアセチル)-N'-(7-ニトロベンツ-2-オキサ-1,3-ジアゾール-4-イイル)エチレンジアミン部分、 手動で、精力的に最小化し、C352(NBD-C2Lac.......

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

これらのアッセイの結果は、蛍光脂質センサーのシグナルに直接依存します。したがって、これらのプローブの精製は、NBDと1:1の比率で、かつ無料のNBDフルオロフォア汚染なしに標識され、このプロトコルの重要なステップです。また、検査中のLTPが適切に折り畳まれ、集計されていないかどうかを確認することも必須です。抽出アッセイで試験したLTPの量は、このLTPがこれらの脂質を効率的に抽出するかどうかを適切に測定するために、アクセス可能なPSまたはPI(4)P分子の量と同等以上でなければならない。実際、NBD-C2ラクトとNBD-PHFAPPは、それぞれ、古典的な飽和結合曲線に従って、PSおよびPI(4)Pに結合する。PSとPI(4)Pのそれぞれの親和性を考えると、これらのプローブは、リポソームにリポソームの残存痕跡が含まれていても、リポソームに大部分が結合したままである。これは、LTPが効率的にこれらの脂質を抽出しないという誤った結論につながることができます。このプロトコルは、標準および市販のPC、PS、およびPI(4)P亜種(18:1/18:1-PC、16:0/18:1-PS、および16:0/16:.......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者らは、利益相反はないと宣言している。

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

原稿を慎重に校正してくれたA.カットトリス博士に感謝しています。この研究は、フランス国家研究庁の助成金ExCHANGE(ANR-16-CE13-0006)とCNRSによって資金提供されています。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
 L-システイン ≥97 % (FG) SigmaW326305-100G10 mM L-システイン原液を水に調製します。アリコートは -20 ° で保存されます。C
2 mL Amber Vial, PTFE/Rub Lnr, for lipids storage in CHCL3WheatonW224681
4 mm-diameter glass beadsSigmaZ265934-1EA
50 mL 円錐形遠心分離管Falcon
ÄKTA清浄機GEヘルスケアFPLC
アルミホイル
アミコンウルトラ-15 MWCOが3 kDaおよび10 kDaメルクUFC900324、UFC901024
アミコンウルトラ-4がMWCOの3および10 kDaメルクUFC800324、
アンピシリンろ過および滅菌水で50 mg / mLのストック溶液を準備し、-20 &度;C.
ベスタチンシグマB8385-10mg
BL21ゴールドコンピテントセルアジレント
C16:0 Liss (Rhod-PE) CHCl3 (1 mg/mL)Avanti Polar Lipids810158C-5MG
C16:0/C16:0-PI(4)P  Echelon LipidsP-4016-3C16:0/C16:0-PI(4)P 粉末 1 mg を 250 & micro に溶解します。MeOHおよび250µのL;CHCl3のL。その後、CHCl3を1mLまで充填します。解決策は明確でなければなりません。
CHCl3 (10 mg/mL)中のC16:0/C18:1-PS (POPS)Avanti Polar Lipids840034C-25mg
C18:1/C18:1-PC (DOPC) in CHCl3 (25 mg/mL)Avanti Polar Lipids850375C-500mg
CaCl2 シグマ10 mM CaCl2 ストック溶液を水中に調製します。
細胞かく乱物質コンスタントダイナミクス
クロロホルム (CHCl3) RPE-ISOカルロ・エルバ438601
完全 EDTA フリープロテアーゼ阻害剤カクテルロシュ5056489001
脱イオン (Milli-Q) 水
ジメチルホルムアミド (DMF)、無水、純度
>99%DNAse I 組換え、RNAseフリー、粉末Roche10104159001
DTT EuromedexEU0006-BMilli-Q水で1 M DTTストック溶液を調製します。 1mLのアリコートを調製し、-20°Cで保存します。
Econo-Pacクロマトグラフィーカラム(1.5 × 12 cm)。Biorad7321010
エレクトロポレーションキュベット 2 mmOzymeEP102
エレクトロポレーター エッペンドルフ 2510エッペンドルフ
固定角ローター Ti45 および Ti45 チューブベックマンバセリアル ライセート
ガラスシリンジ (10、25、50 µL)蛍光実験用ハミルトン
ガラスシリンジ(25、100、250、500、および1000 µL) 脂質ストック溶液を扱うためハミルトン1702RNR、1710RNR、1725RNR、1750RN タイプ3、1001RN
グルタチオン セファロース 4B ビーズGE ヘルスケア17-0756-05
グリセロール (純度 99%)シグマG5516-500ML
キャップ
HEPES、純度 >99%シグマH3375-500G
イラストラNAP 10脱塩カラムGEヘルスケア GE17-0854-02
イソプロピル &β;-D-1-チオガラクトピラノシド(IPTG) EuromedexEU0008-BMilli-Qwaterで1 M IPTGストック溶液を調製します。1mLのアリコートを調製し、-20°Cで保存します。
K-アセテートProlabo26664.293
レノックス LB グルコースmilli-Q 水で調製し、オートクレーブ滅菌しました。
液体窒素リンデ
メタノール(MeOH)≥99.8%VWR20847.24
MgCl2Sigma2 M MgCl2溶液を準備します。0.45 µmフィルター。 
マイクロプレート 96 ウェル PS F-Botom Black 非結合性 Greiner Bio-one655900
ミニ押出機 1 mL 気密性 Hamilton シリンジ 2 個付きAvanti Polar Lipids610023
モノクロメーターベースの蛍光プレートリーダーTECANM1000 Pro
N,N'-ジメチル-N-(ヨードアセチル)-N'-(7-ニトロベンズ-2-オキサ-1,3-ジアゾール-4-イル)エチレンジアミン) (IANBD Amide)分子プローブ25 mg の IANBD を 2.5 mL のジメチルスルホキシド (DMSO) に溶解し、100 μ の 25 アリコートを調製します。1.5 mLスクリューキャップチューブのL。キャップを完全にねじ込まないでください。次に、凍結乾燥機でDMSOを除去し、チューブあたり1 mgの乾燥IANBDを取得します。チューブは閉じて-20°Cで保管されます。暗闇の中のC.  
NaClSigmaS3014-1KG
PBS137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM NaH2PO4, 1.8 mM KH2PO4、オートクレーブ滅菌済み、摂氏4°Cで保存。
洋ナシ型ガラスフラスコ(25mL、14/23、デュランガラス)デュラングループ
ペプスタチンシグマp5318-25mg
pGEX-C2LACT  プラスミドご要望に応じてラボから入手可能
pGEX-PHFAPPプラスミド
ニルメチルスルホニルフッ化物(PMSF)からご要望に応じて入手可能≥98.5% (GC)SigmaP7626-25gに 200 mM PMSF ストック溶液を調製
mAvanti Polar Lipids610006
Poly-Prep クロマトグラフィーカラム(ベッド容量 0-2 mL と 10 mL リザーバー付き)Biorad7311550
Prefilters(直径 10 mm)。Avanti Polar Lipids610014
PyMOLhttp://pymol.org/タンパク質の3Dモデルの構築(図1A)
UV/可視蛍光用石英キュベット(最小容量600 & micro;L)Hellma
Quartz cuvettesHellma
冷蔵遠心分離機 Eppendorf 5427REppendorf
ロータリーエバポレーターBuchiB-100
スクリューキャップ微量遠心チューブ (1.5 mL)Sarsted
小型磁気PFTE攪拌バー (5 × 2 mm)
スナップキャップ微量遠心チューブ (0.5、1、2 mL)Eppendorf
SYPRO orangeSDS-PAGEゲル中のタンパク質を検出するための蛍光染色
サーモミキサースターラボ
トロンビン、ヒト血漿からシグマ106024000011mLのミリQ水に20ユニットを溶解し、25 & micro;0.5 mL Eppendorfチューブ内のLアリコート。その後、凍結して-80°Cで保存します。
トリス、超高純度MP819623
超遠心分離機 L90Kベックマン
UV/可視吸光度計を備えたSAFAS
UV/可視分光蛍光光度計ジャスコまたは島津製作所 ジャスコ FP-8300 または 島津製作所 RF-5301PC
真空チャンバー
セファクリルS200HRGEヘルスケア
ウォーターバスJulabo
ののUFC801024の紡績付き溶血チューブを含まないブロス培地 フェ イソプロパノール ホスホラミドン Sigma R7385-10mg ポリカーボネート フィルター (直径 19 mm) し、細孔径 0.2 µ 温度制御セルホルダーと攪拌装置を詰めた XK 16/70カラム

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Drin, G. Topological regulation of lipid balance in cells. Annual Review of Biochemistry. 83, 51-77 (2014).
  2. Bigay, J., Antonny, B. Curvature, lipid packing, and electrostatics of membrane organelles: defining cellul....

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