Hier beschreiben wir Protokolle mit fluoreszierenden Lipidsensoren und Liposomen, um festzustellen, ob ein Protein Phosphatidylserin oder Phosphatidylinositol-4-phosphat in vitroextrahiert und transportiert.
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Methodenartikel
Fluoreszenzbasierte Messungen des Phosphatidylserin/Phosphatidylinositol-4-Phosphat-Austauschs zwischen Membranen
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Mehrere Mitglieder der evolutionär konservierten Oxysterol-bindenden Protein (OSBP)-verwandten Proteine (ORP) / OSBP-Homologe (Osch) Familie wurden kürzlich gefunden, um eine neuartige Lipidtransferprotein (LTP) Gruppe in Hefe und menschlichen Zellen darzustellen. Sie übertragen Phosphatidylserin (PS) aus dem endoplasmatischen Retikulum (ER) über PS/Phosphatidylinositol-4-phosphat (PI(4)P)-Austauschzyklen in die Plasmamembran (PM). Dieser Befund ermöglicht ein besseres Verständnis dafür, wie PS, das für Signalprozesse entscheidend ist, in der Zelle verteilt ist, und die Untersuchung des Zusammenhangs zwischen diesem Prozess und dem Phosphoinositidstoffwechsel (PIP). Die Entwicklung neuer fluoreszenzbasierter Protokolle war entscheidend für die Entdeckung und Charakterisierung dieses neuen zellulären Mechanismus in vitro auf molekularer Ebene. Dieser Artikel beschreibt die Herstellung und den Einsatz von zwei fluoreszierend markierten Lipidsensoren, NBD-C2Lact und NBD-PHFAPP, um die Fähigkeit eines Proteins zu messen, PS oder PI(4)P zu extrahieren und diese Lipide zwischen künstlichen Membranen zu übertragen. Zunächst beschreibt das Protokoll, wie hochreine Proben dieser beiden Konstrukte produziert, etikettiert und erhalten werden. Zweitens wird in diesem Artikel erläutert, wie diese Sensoren mit einem Fluoreszenz-Mikroplattenleser verwendet werden können, um festzustellen, ob ein Protein PS oder PI(4)P aus Liposomen extrahieren kann, wobei Osh6p als Fallstudie verwendet wird. Schließlich zeigt dieses Protokoll, wie die Kinetik des PS/PI(4)P-Austauschs zwischen Liposomen definierter Lipidzusammensetzung genau gemessen und die Lipidtransferraten durch Fluoreszenzresonanz-Energietransfer (FRET) mit einem Standardfluorometer bestimmt werden können.
Einleitung
Die genaue Verteilung der Lipide zwischen verschiedenen Membranen und innerhalb der Membranen eukaryotischer Zellen1,2 hat tiefgreifende biologische Implikationen. Die Entschlüsselung der Funktionsweise von LTPs ist ein wichtiges Thema in der Zellbiologie3,4,5,6, und In-vitro-Ansätze sind von großem Wert, um dieses Problem anzugehen7,8,9,10,
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Protokoll
1. Reinigung von NBD-C2Lact
HINWEIS: Obwohl dieses Protokoll die Verwendung eines Zelldisruptors zum Aufbrechen von Bakterien beschreibt, kann es modifiziert werden, um andere Lysestrategien zu verwenden(z. B. eine französische Presse). Zu Beginn der Reinigung ist es obligatorisch, einen Puffer zu verwenden, der frisch entgast, filtriert und mit 2 mM Dithiothreitol (DTT) ergänzt wird, um die Oxidation von Cystein zu verhindern. Für den Proteinmarkierungsschritt ist es jedoch entscheidend, DTT vollständig zu entfernen. Viele Schritte müssen auf Eis oder in einem kühlen Raum durchgeführt werden, um einen Proteinabbau zu verm....
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Ergebnisse
Abbildung 1: Beschreibung der fluoreszierenden Lipidsensoren und In-vitro-Assays. (A) Dreidimensionale Modelle von NBD-C2Lact und NBD-PHFAPP basierend auf der Kristallstruktur der C2-Domäne von Rinderlactadherin (PDB-ID: 3BN648) und der NMR-Struktur der PH-Domäne des menschlichen FAPP1-P.......
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Diskussion
Die Ergebnisse dieser Assays hängen direkt von den Signalen der fluoreszierenden Lipidsensoren ab. Daher ist die Reinigung dieser Sonden, die im Verhältnis 1:1 mit NBD und ohne freie NBD-Fluorophorkontamination markiert sind, ein kritischer Schritt in diesem Protokoll. Es ist auch obligatorisch zu überprüfen, ob das zu untersuchende LTP ordnungsgemäß gefaltet und nicht aggregiert ist. Die Menge an LTP, die in den Extraktionsassays getestet wurde, muss gleich oder höher als die von zugänglichen PS- oder PI(4)P-Molekülen s.......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte vorliegen.
Danksagungen
Wir danken Dr. A. Cuttriss für ihr sorgfältiges Korrekturlesen des Manuskripts. Diese Arbeit wird durch den Zuschuss der französischen Nationalen Forschungsagentur ExCHANGE (ANR-16-CE13-0006) und durch das CNRS finanziert.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| L-Cystein ≥ 97 % (FG) | Sigma | W326305-100G | Bereiten Sie eine 10 mM L-Cystein-Stammlösung in Wasser vor. Aliquots werden bei -20 ° gelagert; C |
| 2 mL Braunes Fläschchen, PTFE/Rub Lnr, für die Lagerung von Lipiden in CHCL3 | Wheaton | W224681 | |
| Glasperlen mit 4 mm Durchmesser | Sigma | Z265934-1EA | |
| 50 mL konisches Zentrifugenröhrchen | Falcon | ||
| Ä KTA-Reiniger | GE Healthcare | FPLC | |
| Aluminiumfolie | |||
| Amicon Ultra-15 mit einem MWCO von 3 und 10 kDa | Merck | UFC900324, UFC901024 | |
| Amicon Ultra-4 mit einem MWCO von 3 und 10 kDa | Merck | UFC800324, UFC801024 | |
| Ampicillin | Bereiten Sie eine 50 mg/ml-Stammlösung mit gefiltertem und sterilisiertem Wasser vor und lagern Sie sie bei -20 & °C. | ||
| Bestatin | Sigma | B8385-10mg | |
| BL21 Gold Kompetente Zellen | Agilent | ||
| C16:0 Liss (Rhod-PE) in CHCl3 (1 mg/ml) | Avanti Polare Lipide | 810158C-5MG | |
| C16:0/C16:0-PI(4)P | Echelon Lipids | P-4016-3 | Lösen Sie 1 mg C16:0/C16:0-PI(4)P Pulver in 250 &; Mikro; L von MeOH und 250 µ L von CHCl3. Vervollständigen Sie dann mit CHCl3 auf 1 mL. Die Lösung muss klar werden. |
| C16:0/C18:1-PS (POPS) in CHCl3 (10 mg/ml) | Avanti Polare Lipide | 840034C-25mg | |
| C18:1/C18:1-PC (DOPC) in CHCl3 (25 mg/ml) | Avanti Polare Lipide | 850375C-500mg | |
| CaCl2 | Sigma | Bereiten Sie 10 mM CaCl2 Stammlösung in Wasser vor. | |
| Cell Disruptor | Constant Dynamics | ||
| Chloroform (CHCl3) RPE-ISO | Carlo Erba | 438601 | |
| Vollständiger EDTA-freier Proteaseinhibitor-Cocktail | Roche | 5056489001 | |
| deionisiertes (Milli-Q) Wasser | |||
| Dimethylformamid (DMF), wasserfrei, >99% rein | |||
| DNAse I Rekombinant, RNAsefrei, in Pulverform | Roche | 10104159001 | |
| DTT | Euromedex | EU0006-B | 1 M DTT Stammlösung in Milli-Q Wasser herstellen. Bereiten Sie 1 ml Aliquote vor und lagern Sie sie bei -20 °C. |
| Econo-Pac Chromatographie-Säulen (1,5 & 12 cm). | Biorad | 7321010 | |
| Elektroporationsküvette 2 mm | Ozyme | EP102 | |
| Elektroporator Eppendorf 2510 | Eppendorf | ||
| Festwinkelrotor Ti45 und Ti45 | Röhrchen Beckman | Spinnen der Batzeriallysate | |
| Glasspritzen (10, 25 und 50 & Mikro) L) für das Fluoreszenzexperiment | Hamilton | ||
| Glasspritzen (25 , 100, 250, 500 und 1000 µ L) zur Handhabung von Lipid-Stammlösungen | Hamilton | 1702RNR, 1710RNR, 1725RNR, 1750RN Typ3, 1001RN | |
| Glutathion Sepharose 4B Kügelchen | GE Healthcare | 17-0756-05 | |
| Glycerin (99% rein) | Sigma | G5516-500ML | |
| Hämolyse-Röhrchen mit Kappe | |||
| HEPES, >99 % rein | Sigma | H3375-500G | |
| Illustra NAP 10 Entsalzungssäule | GE healthcare | GE17-0854-02 | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) | Euromedex | EU0008-B | Bereiten Sie 1 M IPTG-Stammlösung in Milli-Qwater vor. Bereiten Sie 1 ml Aliquote vor und lagern Sie sie bei -20 °C. |
| K-Acetat | Prolabo | 26664.293 | |
| Lennox LB Bouillonmedium ohne Glukose | Zubereitet mit Milli-Q-Wasser und autoklaviert. | ||
| Flüssiger Stickstoff | Linde | ||
| Methanol (MeOH) ≥ 99,8% | VWR | 20847,24 | |
| MgCl2 | Sigma | Bereiten Sie eine 2 M MgCl2 Lösung vor. Filtrieren Sie die Lösung mit einem 0,45 &μ; m Filter. | |
| Mikroplatte 96 Well PS F-Botom Black Non-Binding | Greiner Bio-one | 655900 | |
| Mini-Extruder mit zwei 1 mL gasdichten Hamilton | Spritzen Avanti Polar Lipids | 610023 | |
| Monochromator-basierter Fluoreszenzplatten-Reader | TECAN | M1000 Pro | |
| N,N'-Dimethyl-N-(Iodacetyl)-N'-(7-Nitrobenz-2-Oxa-1,3-Diazol-4-yl)Ethylendiamin) (IANBD Amide) | Molekulare Sonden | Lösen Sie 25 mg IANBD in 2,5 ml Dimethylsulfoxid (DMSO) und bereiten Sie 25 Aliquot von 100 & Mikro vor; L in 1,5 mL Schraubverschluss-Röhrchen. Schrauben Sie die Kappe nicht vollständig auf. Entfernen Sie dann DMSO in einem Gefriertrockner, um 1 mg trockenes IANBD pro Tube zu erhalten. Die Röhrchen werden verschlossen und bei -20 Grad gelagert; C im Dunkeln. | |
| NaCl | Sigma | S3014-1KG | |
| PBS | 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM NaH2PO4, 1,8 mM KH2PO4, autoklaviert und bei 4 °C gelagert. | ||
| Birnenförmige Glaskolben (25 mL, 14/23, Duran-Glas) | Duran Group | ||
| Pepstatin | Sigma | p5318-25mg | |
| pGEX-C2LACT plasmid | Auf Anfrage in unserem Labor | ||
| erhältlich pGEX-PHFAPP Plasmid | Auf Anfrage in unserem Labor erhältlich | ||
| Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) ≥ 98,5 % (GC) | Sigma | P7626-25g | Bereiten Sie eine 200 mM PMSF-Stammlösung in Isopropanol |
| Phosphoramidon | Sigma | R7385-10mg | |
| Polycarbonat-Filtern (19 mm Durchmesser) mit einer Porengröße von 0,2 & Mikro m | Avanti Polar Lipids | 610006 | |
| Poly-Prep Chromatographiesäule (mit einem Bettvolumen von 0-2 mL und einem 10 mL Reservoir) | Biorad | 7311550 | |
| Vorfilter (10 mm Durchmesser). | Avanti Polar Lipids | 610014 | |
| PyMOL | http://pymol.org/ | Konstruktion der 3D-Modelle der Proteine (Abbildung 1A) | |
| Quarzküvette für UV/sichtbare Fluoreszenz (Mindestvolumen von 600 &μ; L) | Hellma | ||
| Quarzküvetten | Hellma | ||
| Kühlzentrifuge Eppendorf 5427R | Eppendorf | ||
| Rotationsverdampfer | Büchi | B-100 | |
| Mikrozentrifugenröhrchen mit Schraubverschluss (1,5 mL) | Sarsted | ||
| Kleiner magnetischer PFTE-Rührstab (5 &; 2 mm) | |||
| Mikrozentrifugenröhrchen mit Schnappverschluss (0,5, 1 und 2 mL) | Eppendorf | ||
| SYPRO orange | Fluoreszenzfärbung zum Nachweis von Proteinen im SDS-PAGE Gel | ||
| Thermomixer | Starlab | ||
| THROMBIN, AUS MENSCHLICHEM PLASMA | Sigma | 10602400001 | Lösen Sie 20 Einheiten in 1 mL Milli-Q-Wasser auf und bereiten Sie 25 & micro; L Aliquots in 0,5 mL Eppendorf Röhrchen. Dann einfrieren und bei -80 °C lagern. |
| Tris, ultrareines | MP | 819623 | |
| Ultrazentrifuge L90K | Beckman | ||
| UV/sichtbares Absorptionsspektrophotometer | SAFAS | ||
| UV/sichtbares Spektrofluorometer mit temperaturgesteuertem Küvettenhalter und Rührvorrichtung | Jasco oder Shimadzu | Jasco FP-8300 oder Shimadzu RF-5301PC | |
| Vakuumkammer | |||
| Wasserbad | Julabo | ||
| XK 16/70 Säule gepackt mit Sephacryl S200HR | GE healthcare |
Referenzen
- Drin, G. Topological regulation of lipid balance in cells. Annual Review of Biochemistry. 83, 51-77 (2014).
- Bigay, J., Antonny, B. Curvature, lipid packing, and electrostatics of membrane organelles: defining cellul....
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Nachdrucke und Genehmigungen
