여기에서는 빠른 그리드 제작과 시간 해결 실험을 수행하기 위해 빠른 혼합 및 동결을 위한 신속한 그리드 제작 장치를 사용하기 위한 자세한 프로토콜을 제공합니다.
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이 논문에서
요약
초록
저온 전자 현미경 검사법(cryo-EM) 분야는 새로운 하드웨어 및 처리 알고리즘으로 빠르게 발전하여 더 까다로운 시스템에 대한 고해상도 구조와 정보를 생성하고 있습니다. 저온-EM에 대한 샘플 준비는 기존의 블로팅 시스템을 대체하기 위해 새로운 접근 방식이 개발되면서 유사한 혁명을 겪고 있습니다. 여기에는 압전 전기 디스펜서, 핀 인쇄 및 직접 살포의 사용이 포함됩니다. 이러한 발전의 결과로 그리드 준비 속도는 초에서 밀리초로 이동하여 특히 단백질과 기판이 급락하기 전에 빠르게 혼합될 수 있는 시간 해결 된 냉동 고극 EM 분야에서 짧은 수명 중간 상태를 트래핑하는 새로운 기회를 제공합니다. 여기에서는 표준 빠른 그리드 준비와 시간 해결 실험을 위해 사내 시간 해결 EM 장치에서 그리드를 만들기 위한 표준 프로토콜을 자세히 설명합니다. 이 프로토콜은 4개의 그리드의 제조를 위해 ≥ 2 mg/mL의 농도에서 약 50 μL 샘플을 요구합니다. 샘플 응용 프로그램과 동결 사이의 지연은 10 ms만큼 낮을 수 있습니다. 한 가지 제한은 더 빠른 속도로 얼음 두께가 증가하고 블로팅 방법에 비해 증가한다는 것입니다. 이 프로토콜이 다른 사람들이 자신의 그리드 제작 장치와 시간 해결 된 실험을 설계하는 데 도움이되기를 바랍니다.
서론
배경
냉동 전자 현미경 검사법 (극저온-EM)의 최근 개발은 고해상도에서 점점 더 복잡해지는 시스템의 구조 연구를 가능하게했습니다. 몇 가지 예외를 제외하고, 이러한 연구는 평형1 또는 상대적으로 느린 반응2에서생물학적 거대 분자로 제한되었습니다. 생체 내 많은 프로세스는 더 빠른 시간 척도(밀리초)에서 발생하며 이러한 기간3에서시간 해결 된 저온 EM (TrEM)에 대한 관심이 증가하고 있습니다. 그러나, 블로팅 방법에 의한 종래의 극저온-EM 샘플 제제는 밀리초 TrEM에 비해 너무 느립니다.
블로팅 방법은 가난한 시간 해결 외에 다른 제한이 있습니다. 단백질 및 단백질 복합체는 그리드4에서데우레이션 또는 선호하는 방향으로 고통받을 수 있다. 시료 준비 중 공기-물 인터페이스에 대한 노출 시간을 줄이는 것은 바람직한 방향 및 단백질 탈약5,6을완화하는 것으로 나타났다. 따라서 빠른 그리드 준비는 밀리초 TrEM을 가....
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프로토콜
1. 시스템 준비
참고: 다음 프로토콜에서는 단일 샘플의 그리드를 준비하는 방법을 설명합니다. 일반적으로 복제 그리드는 각 샘플 또는 조건에 대해 최소 2개의 복제 그리드가 준비됩니다. 빠른 플런지 속도(~ 20ms 시간 지연 미만)의 경우 일반적으로 3 또는 4개의 복제 그리드가 얇은 얼음 영역의 감소를 고려하여 준비됩니다.
- 단백질 샘플을 원하는 완충제의 목표 농도로 희석시. 일반적으로 최종 농도는 TED와 그리드 준비를 위해 2 mg/mL≥ 잘 작동합니다. 샘플은 10단계까지 얼음 위에 보관할 수 있으며, 10단계 부터 는 3-4 그리드를 준비하는 데 약 20분이 걸리므로 실온에서 상당한 시간을 보낼 수 있습니다.
- TED를 켭니다. 그런 다음 제어 PC를 켜고 제어 소프트웨어를 시작합니다.
- 각 주사기 펌프의 이니셜화 버튼(아래 검정 버튼)을 눌러 모든 주사기 펌프를 초기화합니다.
- 강력한 전원 공급 장치를 켜고 9V로 설정하고 오실로스코프 제어 소프트웨어를 시작합니다.
- N 2-실린더의레귤레이터 밸브가 닫혀 있는지 확인합니다. 실린더 밸브를 엽니다. 그런 다음, 분무 가스 압력(일반적으로 1-2 bar)에....
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결과
TED와의 빠른 그리드 준비
빠른 그리드 준비를 위한 시험 표본으로서, 우리는 30mHEPES, 150 mM MM NaCl, pH 7.5에서 20 μM에서 말 비장에서 아포페리틴을 사용했습니다. 3.5 Å 해상도에서 의재건은심판15(도 7A)에기재된 690개의 현미경으로부터 수득하였다. 디포커스 범위는 원시이미지(도 7B)에서입자를 쉽게 식별할 수 있도록 선택되었다. 10-40 ms의 시간 지연으로 제조된 일반적인 그리드는 > 1000개의 현미경 으로 수집할 수 있도록 얇은얼음(도 7C)의충분한 영역을 나타낸다. 결과 분해능은 얼음 두께에 의해 제한될 가능성이 높으며, 다수의 상이한 그리드의 지형 분석에 따르면 96± 33nm 얼음 두께6을나타냈.......
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토론
이 작업의 프로토콜은 직접 분무 및 TrEM 실험을 통해 빠른 그리드 준비에 사용할 수 있습니다. 빠른 그리드 준비는 공기 물 인터페이스5와의입자 상호 작용을 줄이기 위해 사용될 수 있다. 주요 제한 사항은 그리드에서 사용 가능한 샘플 농도 및 얼음 두께입니다. 이러한 제한 내에서 샘플 품질이 양호하다면 프로토콜은 고해상도 저온-EM에 적합한 그리드를 생성합니다.
문제 해결
액체 유량 및 그리드 속도는 그리드에 증착된 액체의 양을 결정합니다. 위에 주어진 예제 설정(액체 유량 5 μL/s 및 플런지 속도 1-2 m/s)를 사용하면 방울이 있는 그리드의 좋은 커버리지가 예상됩니다. 노즐이 잘 정렬되지 않은 경우 (그래서 스프레이 방울이 그리드를 그리워), 냉동 그리드는 거의 또는 전혀 방울을 보여줍니다.
그리드의 오염은 완전히 피할 수
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감사의 글
몰리 S.C. 그레이브트에게 유용한 토론과 ABSL 시설 직원에게 cryo-EM 데이터 수집에 도움을 주신 것에 감사드립니다. 데이비드 P. 클레블은 리즈 대학에 의해 투자 애스트베리 센터에서 웰컴 트러스트 4 년 박사 과정 프로그램에 박사 과정 학생입니다. FEI 티탄 크리오스 현미경은 리즈 대학 (UoL ABSL 상)과 웰컴 트러스트 (108466/ Z / 15 / Z)에 의해 투자되었다. 이 작품은 스티븐 P. Muench (BB / P026397/1)에 BBSRC 보조금에 의해 지원되었으며 미국 심장 협회 (AMR21-236078)와 하워드 D. 화이트와 미국 국립 보건 원 (171261)의 하워드 D. 화이트에 대한 연구 보조금에 의해 지원되었다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
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| <강>시간 분해 장치 | |||
| 아크릴 유리 상자 | 미국 과학적인 | ||
| 디지털 습도/온도 컨트롤러 | THE20 디지털 습도/온도 컨트롤러 | ||
| 듀얼로드 공압 실린더 | 듀얼로드 공압 실린더 TN 10x70 | ||
| FEP 튜빙 | 업처치 사이언티픽 1/16" O.D., 0.01'' I.D. FEP 튜빙 | ||
| 플랜지리스 피팅 | Upchurch Scientific ETFE/ETFE 플랜지 리스 피팅 | ||
| 유연한 강화 PVC 튜빙 | 12mm OD. 유연한 강화 PVC 튜빙 | ||
| 유리 주사기 | Kloehn 250 µ L 제로 데드 볼륨 | ||
| 가습기 펌프 | Aqua Air AP3 | ||
| 액체 에탄 용기 | 해석 VitrobotTM Mark IV | ||
| 다단 레귤레이터 | GASARC 클래스 3 다단 레귤레이터 | ||
| 음압 핀셋 | Dumont N5 Inox B 음압 핀셋 | ||
| 오실로스코프 | Hantek 6022BE 오실로스코프 | ||
| PE 튜빙 | Scientific Commodities Inc. 0.043" 외경, 0.015" I.D. PE 튜빙 | ||
| 전원 공급 장치 | Mean Well GSM160A24-R7B | ||
| 전원 공급 장치 | Wanptek KPS305D 전원 공급 장치 | ||
| PU 튜빙 | SMC TU0425 4mm O.D., 2.5mm I.D. PU 튜빙 | ||
| 레귤레이터 | Norgren R72G-2GK-RMN | ||
| 슬라이드 전위차계 | PS100 슬라이드 전위차계 | ||
| 솔레노이드 밸브 | SMC NVJ314M 솔레노이드 밸브 | ||
| 주사기 구동 펌프 | Kloehn V6 48K 모델 | ||
| <강력한>시약 & 재료 | |||
| apoferritin from equine spleen | Sigma-Aldrich, A3660 | ||
| ATP | Sigma-Aldrich, A2383 | ||
| cryo-EM grids | Quantifoil 300 mesh Cu, R 1.2/1.3 | ||
| EGTA | Sigma Aldrich E3889 | ||
| F-actin | H.D. White 제공(준비 절차는 ref. < 참조) sup>1) | ||
| 글로우 디스와 | Cressington 208 탄소 코팅기, 글로우 방전 유닛 | ||
| HEPES | Sigma-Aldrich, H7006 | ||
| KAc | Sigma-Aldrich, P1190 | ||
| MgCl2 | Sigma-Aldrich, M8266 | ||
| MOPS | Sigma-Aldrich, M1254 | ||
| NaCl | Sigma-Aldrich, S9888 | ||
| 골격근 미오신 S1 | H.D. White 제공 (준비 절차는 참조 2 참조) | ||
| 참조 1 | Spudich, J. A. & 와트, S. 토끼 골격근 수축의 조절 I. 트로포미오신 - 트로 포닌 복합체와 액틴 및 미오신 단백질 분해 단편의 상호 작용에 대한 생화학 적 연구. 생물 화학 저널 246, 4866-4871 (1971). | ||
| 참조 2 | White, H. & Taylor, E. actomyosin adenosine triphosphatase의 에너지 및 메커니즘. Biochemistry 15, 5818-5826 (1976). |
참고문헌
- Murphy, B. J., et al. Rotary substates of mitochondrial ATP synthase reveal the basis of flexible F1-Fo coupling. Science. 364, (2019).
- Benton, D. J., Gamblin, S. J., Rosenthal, P. B., Skehel, J. J. Structural transitions in influenza haemagglutinin at memb....
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