يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

عزل وثقافة البلاعم القلبية المقيمة من العقدة الجيبية الأذينية والأذينية البطينية

4.9K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/62236

⸱

مايو 7, 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1University Hospital Munich, Department of Medicine I, Ludwig-Maximilian-Unversity Munich (LMU), 2Insitute of Surgical Research at the Walter Brendel Center of Experimental Medicine, University Hospital Munich, Ludwig-Maximilians-University (LMU), 3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance (MHA)

في هذه المقالة

إشعار تصحيح

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

ملخص

يوفر البروتوكول المقدم هنا نهجا خطوة بخطوة لعزل الضامة القلبية المقيمة من العقدة الجيبية الأذينية (SAN) ومنطقة العقدة الأذينية البطينية (AVN) لقلوب الفئران.

الملخص

وقد ثبت أن البلاعم القلبية المقيمة تسهل التوصيل الكهربائي في القلب. يبدأ إيقاع القلب الفسيولوجي بنبضات كهربائية متولدة في العقدة الجيبية الأذينية (SAN) ثم يتم إجراؤها على البطينين عبر العقدة الأذينية البطينية (AVN). لمزيد من الدراسة لدور البلاعم المقيمة في نظام التوصيل القلبي ، من الضروري عزل البلاعم المقيمة بشكل صحيح عن SAN و AVN ، لكنه لا يزال يمثل تحديا. هنا ، نقدم بروتوكولا للتشريح المجهري الموثوق به ل SAN و AVN في قلوب الفئران متبوعا بعزل وثقافة الضامة المقيمة.

يتم تحديد وتشريح كل من SAN الذي يقع عند تقاطع محطة crista مع الوريد الأجوف العلوي ، و AVN الذي يقع في قمة مثلث Koch ، وتشريحه بشكل دقيق. يتم تأكيد الموقع الصحيح من خلال التحليل النسيجي للأنسجة التي أجريت مع صبغة ماسون ثلاثية الألوان ومضاد HCN4.

ثم يتم هضم الأنسجة المجهرية إنزيميا للحصول على معلقات خلية واحدة تليها الحضانة مع لوحة محددة من الأجسام المضادة الموجهة ضد علامات سطح محددة من نوع الخلية. يسمح ذلك بتحديد أو عد أو عزل مجموعات الخلايا المختلفة عن طريق فرز الخلايا المنشطة بالفلورسنت. للتمييز بين الضامة القلبية المقيمة والخلايا المناعية الأخرى في عضلة القلب ، وخاصة الضامة المشتقة من الخلايا الوحيدة ، هناك حاجة إلى استراتيجية بوابة دقيقة. أولا ، يتم الكشف عن خلايا السلالة اللمفاوية واستبعادها من مزيد من التحليل. بعد ذلك ، يتم تحديد الخلايا النخاعية مع تحديد البلاعم المقيمة من خلال التعبير العالي لكل من CD45 و CD11b ، والتعبير المنخفض عن Ly6C. مع فرز الخلايا ، يمكن بعد ذلك زراعة البلاعم القلبية المعزولة في المختبر على مدار عدة أيام لمزيد من التحقيق. لذلك ، نصف بروتوكولا لعزل البلاعم القلبية الموجودة داخل نظام التوصيل القلبي. نناقش المزالق في التشريح الدقيق وهضم SAN و AVN ، ونقدم استراتيجية بوابات لتحديد الضامة القلبية وعدها وفرزها بشكل موثوق عن طريق فرز الخلايا المنشط بالفلورة.

المقدمة

تبدأ العقدة الجيبية الأذينية (SAN) من الناحية الفسيولوجية النبضة الكهربائية ، وبالتالي فهي جهاز تنظيم ضربات القلب الأساسي. تقوم العقدة الأذينية البطينية (AVN) بتوصيل النبضة الكهربائية من الأذينين إلى البطينين وتعمل أيضا كجهاز تنظيم ضربات القلب الفرعي1. بشكل عام ، يعد توليد وتوصيل النبضات الكهربائية عملية معقدة يمكن تعديلها بواسطة عوامل مختلفة2 ، بما في ذلك البلاعم المقيمة في مناطق SAN / AVN. توضح دراسة حديثة أجراها Hulsmans et al. مجموعة محددة من الضامة القلبية المقيمة التي يتم تخصيبها في AVN وتعمل كلاعبين رئيسيين في الحفاظ على ضربات قلب ثابتة3. ووجدوا أن البلاعم مقترنة كهربائيا بخلايا عضلة القلب ويمكن أن تغير الخصائص الكهربائية لخلايا عضلة القلب المقترنة. لاحظ المؤلفون أيضا أن مثل هذه الخلايا الموصلة التي تتداخل مع الضامة موجودة أيضا في مكونات أخرى من نظام التوصيل القلبي ، مثل SAN.

حاليا ، من غير المعروف تماما ما إذا كان النمط الظاهري للبلاعم القلبية المقيمة يختلف بين مناطق القلب. ومع ذلك ، فقد ثبت أن البيئة المكروية للأنسجة يمكن أن تؤثر على النسخ والتجديد التكاثري للبلاعم الأنسجية4. علاوة على ذلك ، نظرا لأنه ثبت أن النمط الظاهري للخلية العضلية القلبية مختلف بين المناطق ، فقد تكون التأثيرات الوظيفية للبلاعم على خلايا عضلة القلب خاصة بالمنطقة ، حتى لو كان النمط الظاهري للبلاعم نفسه هو نفسه. لذلك ، هناك حاجة إلى مزيد من الدراسات على مناطق قلبية محددة.

أظهرت الدراسات الحديثة أنه في حالة مستقرة ، يتم إنشاء البلاعم المقيمة في الأنسجة قبل الولادة ، وتنشأ بشكل مستقل عن تكون الدم النهائي ، وتستمر حتى مرحلة البلوغ5. ومع ذلك ، بعد استنفاد البلاعم أو أثناء التهاب القلب ، تساهم حيدات Ly6chi في تجديد عدد البلاعم القلبية6. أظهرت الدراسات التي تضمنت تتبع النسب الجيني ، و parabiosis ، ورسم خرائط المصير ، وتتبع الخلايا تعايش مجموعة متنوعة من مجموعات البلاعم المقيمة في الأنسجة في الأعضاء والأنسجة ، وكذلك السلوك الخلوي المختلف للمجموعات الفرعية من البلاعم التي يحتمل أن تكون مرتبطة بتطورها7،8،9.

استفاد توصيف البلاعم القلبية المقيمة من استخدام فرز الخلايا المنشطة المغناطيسية (MACS) وفرز الخلايا المنشطة بالفلورسنت. هذه الطرق مفيدة بشكل خاص لعزل مجموعات خلايا معينة من كسور الأنسجة المتعددة عن طريق تسميتها بعلامات سطح الخلية. هذا لا يؤدي فقط إلى نقاء أعلى لنوع الخلايا المناعية المعزولة ، ولكنه يسمح أيضا بتحليل النمط الظاهري. هنا ، نقدم بروتوكولا يتضمن خلايا مغلفة بالخرز المغناطيسي متبوعا بفرز الخلايا المنشطة بالفلورسنت لإثراء الضامة القلبية المقيمة المعزولة على وجه التحديد من منطقة SAN و AVN.

لاستكشاف خصائص البلاعم القلبية المقيمة في نظام التوصيل ووظيفتها في التوصيل القلبي وعدم انتظام ضربات القلب ، يعد التوطين الدقيق وتشريح SAN و AVN أمرا بالغ الأهمية. للتشريح المجهري ل SAN و AVN ، يتم استخدام المعالم التشريحية لتحديد المنطقة10. باختصار ، يقع SAN عند تقاطع الوريد الأجوف العلوي والأذين الأيمن. يقع AVN داخل مثلث كوخ ، الذي يحده من الأمام نشرة الحاجز للصمام ثلاثي الشرف ، وخلفيا وتر تودارو11. كما نقدم إجراء تشريح دقيق ل SAN و AVN في الفئران وهو ما تؤكده الأنسجة وتلطيخ التألق المناعي.

يمكن استخدام البلاعم المقيمة المعزولة لإجراء مزيد من التجارب مثل تسلسل الحمض النووي الريبي أو يمكن استعادتها وزراعتها لأكثر من أسبوعين مما يسمح بإجراء تجارب مختلفة في المختبر. لذلك ، يصف بروتوكولنا إجراء قيما للغاية لأخصائي الإيقاع المناعي. يوضح الجدول 1 تكوين جميع الحلول اللازمة ، ويبين الشكل 1 معالم التشريح المجهري ل SAN و AVN. الشكل 2 هو توضيح تخطيطي لتوطين SAN و AVN. يوضح الشكل 3 التلوين النسيجي ل SAN و AVN (تلطيخ ماسون ثلاثي الألوان والتألق المناعي). يوضح الشكل 4 استراتيجية بوابة خطوة بخطوة لعزل البلاعم القلبية المقيمة عن طريق فرز الخلايا المنشط بالفلورة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تم إجراء رعاية الحيوان وجميع الإجراءات التجريبية وفقا للمبادئ التوجيهية للجنة رعاية الحيوان والأخلاقيات بجامعة ميونيخ وتمت الموافقة على جميع الإجراءات المتخذة على الفئران من قبل حكومة بافاريا ، ميونيخ ، ألمانيا. تم الحصول على الفئران C57BL6 / J تجاريا.

1. الاستعدادات

  1. قم بإعداد مخزن فرز الخلايا (الجدول 1) وتخزينه في 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: أثناء الإجراء التجريبي بأكمله ، يجب أن يكون المخزن المؤقت لفرز الخلايا دائما على الجليد.
  2. تحضير مخزن الهضم المؤقت (الجدول 1) قبل وقت قصير من عملية الهضم حيث لا يمكن اكتشاف نشاط كولاجيناز إلا لبضع ساعات في درجة حرارة الغرفة.
  3. الرجوع إلى البروتوكول المنشور مسبقا لإعداد طبق التشريح10. باختصار ، أضف 30 مل من هلام الأغاروز (3٪ -4٪) إلى طبق بتري بقطر 100 مم واتركه يبرد في درجة حرارة الغرفة.

2. التضحية بالحيوانات واستئصال القلب

  1. تخدير الفأر باستخدام إيزوفلوران عن طريق وضعه في غرفة حضانة متصلة بمبخر إيزوفلوران وغسله بنسبة 5٪ إيزوفلوران / 95٪ أكسجين.
  2. بعد حقن الفنتانيل للتسكين ، افتح القفص الصدري وقم بتخلل القلب عن طريق حقن 5-10 مل من الثلج البارد 1x PBS مباشرة في البطين الأيسر (LV). استخراج قلب الفئران ووضعه على طبق التشريح. تم وصف التفاصيل التجريبية بالتفصيل سابقا10.

3. تشريح دقيق ل SAN و AVN

  1. بعد عزل القلب ، قم بإجراء عمليات التشريح المجهري التالية في طبق التشريح باستخدام 1x PBS المثلج تحت مجهر التشريح.
  2. استخدم المعالم التشريحية القلبية ، مثل الشريان الأورطي ، الشريان الرئوي ، الجيب التاجي ، البطين الأيسر / الأيمن ، إلخ. لتحديد اليسار / اليمين (اليسار: LV ؛ اليمين: RV) والأمامي / الخلفي (الأمامي: الشريان الأورطي ؛ الخلفي: الجيب التاجي) للقلب. بعد تحديد الاتجاه ، أدر القلب مع الجزء الأمامي منه في أسفل الطبق (لفضح الأوردة الكبيرة الموجودة في الخلف).
  3. تشريح مجهري لشبكة SAN
    ملاحظة: تم وصف التشريح الدقيق لشبكة SAN سابقا10. يتم وصف العملية باختصار أدناه.
    1. كشف المنطقة بين الأجوف عن طريق تثبيت الزوائد الأذينية اليمنى (RAA) والأنسجة المجاورة للوريد الأجوف العلوي (SVC) والوريد الأجوف السفلي (IVC) على طبق التشريح المجهري باستخدام دبابيس الحشرات.
    2. قطع القلب على طول الحاجز بين الأذينين بالتوازي مع crista terminalis (CT) لفصل المنطقة بين الأجوف والحصول على عينة SAN (الشكل 1A ، الشكل 2A). ضع العينة في أنبوب طرد مركزي دقيق فارغ سعة 1.5 مل على الثلج.
  4. تشريح مجهري للانواع اللاوعائي
    1. بعد جمع عينة SAN ، تأكد من أن RAA وأجزاء من الأذين الأيمن (RA) قد تم قطعها بالفعل ولم يتبق سوى الحاجز بين الأذينين (IAS) والحاجز بين البطينين (IVS).
    2. قم بتثبيت الأجزاء المتبقية من القلب من خلال الأنسجة المجاورة ل IAS و IVS باستخدام دبابيس الحشرات لجعل الجانب الأذيني الأيمن من IAS متجها لأعلى.
    3. انظر إلى الأذين الأيمن على سطح الشغاف لمثلث كوخ. سيحده من الأمام الخط المفصلي لنشرة الحاجز للصمام ثلاثي الشرف (TV) ، وخلفيا وتر تودارو. لوحظ فتحة الجيب التاجي في القاعدة. (الشكل 1 ب ، الشكل 2 ب).
    4. قطع مثلث كوخ ، الذي يحتوي على AVN ، ووضعه مباشرة في أنبوب طرد مركزي دقيق فارغ سعة 1.5 مل على الجليد.

4. الهضم

  1. تحضير مخزن الهضم المؤقت (الجدول 1) قبل وقت قصير من الاستخدام.
  2. فرم أنسجة SAN و AVN جيدا باستخدام المشارط.
    ملاحظة: فرم الأنسجة جيدا سيزيد من كفاءة الهضم ويساعد في الحصول على تعليق خلوي جيد للفرز. نظرا لأن عينات SAN و AVN صغيرة جدا ، يوصى بفرم الأنسجة مباشرة داخل أنبوب الطرد المركزي الدقيق سعة 1.5 مل لتقليل فقد العينة.
  3. أضف 500 ميكرولتر من محلول الهضم لكل عينة واغسل جميع الأنسجة المفرومة من جدار أنبوب الطرد المركزي الدقيق سعة 1.5 مل. يساعد السحب اللطيف على هضم العينة.
  4. تجانس الأنبوب على آلة دوامة (الإعدادات: 37 درجة مئوية ، 750 دورة في الدقيقة لمدة 1 ساعة).
  5. بعد الهضم ، انقل معلق الأنسجة إلى أنبوب طرد مركزي جديد سعة 15 مل عن طريق المرور عبر مصفاة خلية 40 ميكرومتر. شطف مصفاة الخلية مع 5 مل إضافية من عازلة فرز الخلايا لوقف عملية الهضم.
  6. جهاز طرد مركزي لأنبوب 15 مل عند 350 × جم لمدة 7 دقائق عند 4 درجات مئوية. ثم قم بإزالة الطافت تماما باستخدام ماصة. أعد تعليق حبيبات الخلية باستخدام مخزن مؤقت لفرز الخلايا 90 ميكرولتر.
    ملاحظة: قبل الفصل المغناطيسي ، ماصة تعليق الخلية برفق عدة مرات أو تمر عبر مصفاة خلية 30 ميكرومتر لإزالة كتل الخلايا إذا لزم الأمر ، للحصول على تعليق خلية واحدة للحصول على الأداء الأمثل للإثراء المغناطيسي لمجموعات الخلايا المثيرة للاهتمام.

5. التخصيب المغناطيسي ل CD45 وتلطيخ العينة

ملاحظة: لعزل البلاعم القلبية بكفاءة فرز عالية ، تم إجراء استبعاد الخلايا غير المرغوب فيها بما في ذلك الخلايا الليمفاوية باستخدام ميكروبيدات CD45 وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. بناء على لوحة الفرز ، تم تحديد الضامة المقيمة القلبية على أنها CD45 عالية CD11b عالية CD64 عالية Ly6C منخفضة /int F4 /80 عالية.

  1. أضف 10 ميكرولتر من ميكروبيدات CD45 لكل 107 خلايا إجمالية إلى تعليق الخلية في أنبوب الطرد المركزي سعة 15 مل. اخلطي العينات جيدا واحتضنيها لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: يجب إجراء عد الخلايا باستخدام مقياس الدم لفترة وجيزة للتأكد من أن كل أنبوب لا يحتوي على أكثر من 107 خلايا إجمالا. عند العمل مع أرقام خلايا أعلى ، يجب زيادة حجم الخرز المغناطيسي.
  2. تحضير خليط الأجسام المضادة عن طريق تخفيف الأجسام المضادة التالية في مخزن فرز الخلايا (تخفيف 1: 100 لكل جسم مضاد): CD45-PE ، CD11b-APC-Cy7 ، CD64-APC ، F4 / 80-PE-Cy7 ، Ly6C-FITC. ستتم إضافة DAPI لاحقا إلى تلطيخ التمييز الحي / الميت.
  3. بعد 15 دقيقة من حضانة الخرزة المغناطيسية ، أضف 100 ميكرولتر من خليط الأجسام المضادة مباشرة إلى معلق الخلية في أنبوب 15 مل (ثم يكون التركيز النهائي لجميع الأجسام المضادة 1: 200) واحتضانها لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
  4. بعد 20 دقيقة من حضانة الأجسام المضادة ، اغسل معلق الخلية بإضافة 1-2 مل من المخزن المؤقت لفرز الخلايا لكل 107 خلايا وأجهزة طرد مركزي عند 350 × جم لمدة 10 دقائق. قم بإزالة المادة الطافية تماما عن طريق سحب العينات.
  5. أعد تعليق ما يصل إلى 108 خلايا في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت لفرز الخلايا.
    ملاحظة: يجب تحديد الحد الأقصى لعدد الخلايا للفصل المغناطيسي وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
  6. تحضير مجموعة الفصل المغناطيسي.
    1. قم بتوصيل العمود المغناطيسي بفاصل مغناطيسي مناسب وضع أنبوب تجميع أسفل العمود المغناطيسي.
    2. قم بإعداد الأعمدة المغناطيسية عن طريق الشطف باستخدام المخزن المؤقت لفرز الخلايا: أضف 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت لفرز الخلايا في الجزء العلوي من العمود واترك المخزن المؤقت يمر.
  7. قم بتطبيق تعليق الخلية على الفور على العمود أثناء مرور المخزن المؤقت لفرز الخلايا.
    ملاحظة: تجنب تكوين فقاعات الهواء في العمود. وفقا لبروتوكول التصنيع ، على الرغم من أن وقت ملء العمود قد يتغير من ظروف التخزين ، إلا أنه ليس له أي تأثير على جودة الفصل.
  8. اغسل العمود بمخزن مؤقت لفرز الخلايا 3 × 500 ميكرولتر. يحتوي التدفق في الخطوة 5.7 والخطوة 5.8 على خلايا غير مسماة ، والتي يمكن التخلص منها إذا لم تكن هناك حاجة إلى مزيد من التجربة.
    ملاحظة: إضافة المخزن المؤقت لفرز الخلايا مباشرة عندما يكون خزان العمود فارغا تقريبا.
  9. قم بإزالة العمود من الفاصل المغناطيسي وضعه على أنبوب تجميع جديد.
  10. أضف 1 مل من المخزن المؤقت لفرز الخلايا إلى العمود. اغسل العمود على الفور عن طريق تطبيق المكبس المرفق مع العمود بإحكام. يحتوي التدفق من خلال الخلايا المسماة مغناطيسيا.
  11. أضف محلول DAPI إلى جميع معلقات الخلايا التي تم جمعها مغناطيسيا قبل وقت قصير من تشغيلها على فارز الخلايا. اضبط التركيز النهائي ل DAPI على 0.3-0.5 ميكروغرام / مل.
  12. إجراء تحليل FACS.

6. عينات للتعويض

  1. قم بإعداد 6 أنابيب طرد مركزي دقيقة بنية سعة 1.5 مل تحمل علامة "PE" و "APC-Cy7" و "APC" و "PE-Cy7" و "FITC" و "DAPI" على التوالي لحماية الأجسام المضادة من الضوء. قم بإعداد أنبوب طرد مركزي دقيق آخر سعة 1.5 مل يسمى "غير ملوث".
    ملاحظة: يمكن القيام بذلك في نفس الوقت الذي يتم فيه احتضان معلق الخلية بالميكروبيدات والأجسام المضادة. يمكن أن تكون العينة غير الملوثة هي نسيج عضلة القلب الذي تم جمعه عشوائيا من أنسجة القلب التي تم تجنيبها ومعالجتها أيضا وفقا للخطوة 4.
  2. قم بتخفيف كل جسم مضاد مترافق مع مخزن فرز الخلايا إلى 1:50 في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة البنية سعة 1.5 مل والتي تم تمييزها وفقا لذلك.
  3. أضيفي قطرة واحدة من محلول الخرز التعويضي واحتضنيه لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
  4. أضف 2 مل من المخزن المؤقت لفرز الخلايا في كل أنبوب طرد مركزي بني سعة 1.5 مل وأجهزة طرد مركزي بسرعة 450 × جم لمدة 5 دقائق. تخلص تماما من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات المحتوية على حبة مع مخزن مؤقت لفرز الخلايا 300 ميكرولتر وانقلها إلى أنابيب فرز الخلايا التي تم تمييزها أيضا وفقا لذلك.

7. تشغيل على فارز الخلايا واستراتيجية البوابة

  1. قم بتطبيق العينة غير الملوثة وأنابيب التعويض أولا واضبط الفولتية لكل قناة لمحاذاة كل من الذروة الموجبة والسالبة إلى الموضع المناسب للمحور. احفظ إعدادات التعويض وقم بتطبيقها على العينات التالية.
  2. قم بتطبيق العينات على فارز الخلايا. قم بتعيين استراتيجية البوابة كما هو موضح في الشكل 4. يتم تحديد الضامة المقيمة في القلب على أنها CD45 عالية CD11b عالية CD64 عالية Ly6C منخفضة /int F4 /80 عالية. يستخدم DAPI كعلامة صلاحية الخلية.
  3. تحقق من مخططات قياس التدفق الخلوي للتأكد من أن عدد الخلايا محل الاهتمام يظهر بشكل صحيح على الرسوم البيانية. إذا لم يكن الأمر كذلك ، فاضبط جهد كل قناة على العرض المركزي لكل مخطط.
  4. إذا كانت إعدادات الجهد مرضية ، فابدأ إجراء الفرز. اجمع عدد الخلايا المصنفة في وسط مزرعة يتكون من DMEM يحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني ، مكمل ب 100 ميكروغرام / مل ستربتومايسين و 100 وحدة / مل بنسلين.

8. ثقافة البلاعم المقيمة

  1. بعد جمع البلاعم التي تم فرزها ، انقل الخلايا على الفور إما إلى أطباق زراعة الأنسجة 35 مم أو 24 صفيحة بئر ، أو استخدمها مباشرة في التجارب اللاحقة.
  2. لزراعة البلاعم المصنفة ، احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية ، حاضنة 5٪ CO2 .
  3. تغيير وسط الثقافة كل 48-72 ساعة. يمكن إزالة الخلايا الميتة العائمة بسهولة عن طريق التغيير المتوسط. استخدم البلاعم الحية المرفقة بقاع طبق الاستزراع للتجربة اللاحقة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

وصفنا إجراء عمليا لعزل الضامة القلبية المقيمة على وجه التحديد من منطقة SAN و AVN. لتأكيد التشريح الصحيح ، يتم إجراء تلطيخ Masson's Trichrome وتلطيخ HCN4 المناعي (الشكل 3) 12. باستخدام هذا البروتوكول ، يمكننا جمع ما يقرب من 60000 بلاعم من قلب واحد كامل. يوضح الشكل 4 استراتيجية البوابة لفرز البلاعم القلبية. تم تحديد البلاعم القلبية الحية على أنها CD45 + CD11b + F4 / 80 + CD64 + Ly6C-. ي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

في هذه المخطوطة ، نصف بروتوكولا لإثراء الضامة القلبية المقيمة على وجه التحديد من مناطق SAN و AVN بنقاوة عالية.

تنقسم البلاعم إلى مجموعات فرعية بناء على موقعها التشريحي والنمط الظاهري الوظيفي. يمكنهم أيضا التبديل من نمط ظاهري وظيفي إلى آخر استجابة لإشارات البيئة الدقيقة المتغيرة13. بالمقارنة مع الأعضاء الأخرى مثل نخاع العظام والكبد ، تحتوي أنسجة القلب على نسبة أقل من الخلايا المناعية وأعداد مطلقة أقل لكل مجموعة فرعية خلوية14. لذلك ، تعد طرق فرز ال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

لم يتم الإبلاغ عن أي تضارب محتمل في المصالح ذات صلة بهذه المقالة.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل من قبل مجلس المنح الدراسية الصيني (CSC ، إلى R. Xia) ، والمركز الألماني لأبحاث القلب والأوعية الدموية (DZHK ؛ 81X2600255 إلى S. Clauss ، و 81Z0600206 إلى S. Kääb ، و 81Z0600204 إلى CS) ، ومؤسسة Corona Foundation (S199 / 10079/2019 إلى S. Clauss) ، و SFB 914 (المشروع Z01 إلى S. Massberg) ، و ERA-NET حول أمراض القلب والأوعية الدموية (ERA-CVD ؛ 01KL1910 إلى S. Clauss) و Heinrich-and-Lotte-Mühlfenzl Stiftung (إلى S. Clauss). لم يكن للممولين أي دور في إعداد المخطوطات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
نظام مبخر <قوي > تخدير < / قوي >
إيزوفلورانHugo Sachs Elektronik34-0458 ، 34-1030 ، 73-4911 ، 34-0415 ، 73-4910يتضمن غرفة تحريض ووحدة تفريغ الغاز وفلاتر الفحم
دائرة Bain المعدلةHugo Sachs Elektronik73-4860يتضمن قناع تخدير للفئران
منصةجراحية كينت العلميةSURGI-M
In vivo< / em> الأجهزة< / strong>
ملقط دقيقةأدوات العلومالدقيقة 11295-51
مقص قزحيةأدوات العلوم الدقيقة14084-08
مقص الربيعأدوات العلوم الدقيقة91500-09
ملقط الأنسجةالعلوم الدقيقة أدوات11051-10
دبابيس الأنسجةأدوات العلوم الدقيقة26007-01يمكن استخدام إبر 27G كبديل
<قوي > أدوات المختبر العامة < / قوي >
شاكر مداريSunlabD-8040
ماصة ، حجم 10ul ، 100ul ، 1000ulEppendorfZ683884-1EA
مغناطيسيIKARH أساسي
< قوي > مجاهر < / قوي >
تشريح ستيريو - تكبير مجهرvwr10836-004
مجهرلايكا أنظمة لايكاDM6
< قوي > آلة قياس التدفق الخلوي < / قوي>
بيكمان كولتركولتر موفلو Astrios
SoftwareFlowJo
v10FlowJo
General Lab Material
0.2 & micro; مرشح المحقنة Msartorius17597
100 مم طبق بتريFalcon351029
27G إبرةBD Microlance 3300635
50 مل أنبوب مخروطي من مادة البولي بروبيلينFALCON352070
زلات الغطاء7632160Eppendorf Tubes
Eppendorf30121872
حقنة 5 ملبراون4606108 فولت
<قوي > كيماويات < / قوي >
0.5 م EDTASigma20-158
حمض الخليكميركمكون 100063من TEA
AgaroseBiozym850070
مصل الأبقار الألبومينSigmaA2153-100G
كولاجيناز Iورثينجتون الكيمياء الحيويةLS004196
كولاجيناز الحادي عشرسيجماC7657
DNase IسيجماD4527
هيالورونيدازسيجماH3506
هيبس عازلةسيجماH4034
مصل الأبقار ألبومينسيجماA2153-100G
DPBS (1X) Dulbecco ' s فوسفات مخزن سالينجيبكو14190-094
مصل الأبقار الجنينيسيجماF2442-500 مل
البنسلين ناقص ؛ StreptomycinSigmaP4083
DMEMGibco41966029
Drugs
Fentanyl 0.5  ملغ / 10   ؛ ملبراون ميلسونجن
إيزوفلوران 1 مل / ملCp-pharma31303
أكسجين 5 لترليند 2020175يتضمن منظم ضغط
<قوي > أجسام مضادة < / قوي >
مضاد للفأر Ly6C FITC (استنساخ HK1.4)BioLegendCat # 128006مخفف إلى 1: 100
مضاد للفأر F4 / 80 PE / Cy7 (استنساخ BM8)BioLegendCat # 123114مخفف إلى 1: 100
مضاد للفأر CD64 APC (استنساخ X54-5 / 7.1)BioLegendCat # 139306مخفف إلى 1: 100
مضاد للفأر CD11b APC / Cy7 (استنساخ M1 / 70) BioLegendCat # 101226مخفف إلى 1: 100
مضاد للفأر CD45 PE (استنساخ 30-F11) BioLegendCat # 103106مخفف إلى 1: 100
Hoechst 33342 ، ثلاثي هيدروكلوريد ، ثلاثي الهيدرات ( DAPI)InvitrogenH3570مخفف إلى 1: 1000
Animals< / strong>
Mouse ، C57BL / 6مختبرات
محرك نهر تشارلز

المراجع

  1. Nikolaidou, T., Aslanidi, O. V., Zhang, H., Efimov, I. R. Structure-function relationship in the sinus and atrioventricular nodes. Pediatric Cardiology. 33 (6), 890-899 (2012).
  2. Clauss, S., et al. Animal models of arrhythmia: classic electrophysiology to genetically modified large animals. Nature Review Cardiology. 16 (8), 457-475 (2019).
  3. Hulsmans, M., et al. Macrophages Facilitate Electrical Conduction in the Heart. Cell. 169 (3), 510-522 (2017).
  4. Rosas, M., et al. The transcription factor Gata6 links tissue macrophage phenotype and proliferative renewal. Science. 344 (6184), 645-648 (2014).
  5. Schulz, C., et al. A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells. Science. 336 (6077), 86-90 (2012).
  6. Epelman, S., et al. Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation. Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).
  7. Gordon, S., Pluddemann, A. Tissue macrophages: heterogeneity and functions. BMC Biology. 15 (1), 53(2017).
  8. Bajpai, G., et al. The human heart contains distinct macrophage subsets with divergent origins and functions. Nature Medicine. 24 (8), 1234-1245 (2018).
  9. Davies, L. C., Jenkins, S. J., Allen, J. E., Taylor, P. R. Tissue-resident macrophages. Nature Immunology. 14 (10), 986-995 (2013).
  10. Xia, R., et al. Whole-mount immunofluorescence staining, confocal imaging and 3D reconstruction of the sinoatrial and atrioventricular node in the mouse. Journal of Visualized Experiments. (166), e62058(2020).
  11. van Weerd, J. H., Christoffels, V. M. The formation and function of the cardiac conduction system. Development. 143 (2), 197-210 (2016).
  12. Ye Sheng, X., et al. Isolation and characterization of atrioventricular nodal cells from neonate rabbit heart. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 4 (6), 936-946 (2011).
  13. Murray, P. J., Wynn, T. A. Protective and pathogenic functions of macrophage subsets. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 723-737 (2011).
  14. Pinto, A. R., et al. Revisiting cardiac cellular composition. Circulation Research. 118 (3), 400-409 (2016).
  15. Bajpai, G., et al. Tissue resident CCR2- and CCR2+ cardiac macrophages differentially orchestrate monocyte recruitment and fate specification following myocardial injury. Circulation Research. 124 (2), 263-278 (2019).
  16. Honold, L., Nahrendorf, M. Resident and monocyte-derived macrophages in cardiovascular disease. Circulation Research. 122 (1), 113-127 (2018).
  17. Leid, J., et al. Primitive embryonic macrophages are required for coronary development and maturation. Circulation Research. 118 (10), 1498-1511 (2016).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

تصحيح


Formal Correction: Erratum: Isolation and Culture of Resident Cardiac Macrophages from the Murine Sinoatrial and Atrioventricular Node
Posted by JoVE Editors on 2/02/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Isolation and Culture of Resident Cardiac Macrophages from the Murine Sinoatrial and Atrioventricular Node. The Authors section was updated from:

Ruibing Xia123
Simone Loy1
Stefan Kääb13
Anna Titova1
Christian Schulz123
Steffen Massberg123
Sebastian Clauss123
1University Hospital Munich, Department of Medicine I Ludwig-Maximilian-Unversity Munich (LMU)
2Walter Brendel Center of Experimental Medicine (WBex) LMU Munich
3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance (MHA)

to:

Ruibing Xia123
Simone Loy1
Stefan Kääb13
Anna Titova1
Christian Schulz123
Steffen Massberg123
Sebastian Clauss123
1University Hospital Munich, Department of Medicine I Ludwig-Maximilian-University Munich (LMU)
2Insitute of Surgical Research at the Walter Brendel Center of Experimental Medicine, University Hospital Munich, Ludwig-Maximilians-University (LMU)
3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance (MHA)

استكشف المزيد من المقالات

عزل البلاعم القلبيةالعقدة الجيبية الأذينيةقلب الفأربروتوكول التشريح الدقيقفرز الخلايا المنشط فلوريسنتياًفرز الخلايا المغناطيسيالجهاز التوصيلي القلبيالخلايا الموجبة لـ CD45علامات الخلايا النخاعية
عزل وثقافة البلاعم القلبية المقيمة من العقدة الجيبية الأذينية والأذينية البطينية
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.