Summary
פרוטוקול זה מתאר את הכימות של וריאציות המודינמיות המוח נפחיות במוח העכבר באמצעות אולטרסאונד פונקציונלי (fUS). נהלים עבור מפת הפעלה פונקציונלית תלת-ממדית בעקבות גירוי חושי כמו גם קישוריות תפקודית של מצב מנוחה מסופקים כדוגמאות להמחשה, בעכברים מרדים וערים.
Abstract
הדמיית אולטרסאונד פונקציונלית (fUS) היא אודל הדמיה מוחית חדשנית הנשענת על מדד הרגישות הגבוהה של נפח הדם המוחי שהושג על ידי אנגיוגרפיה דופלרית אולטרה מהירה. כמו זלוף המוח קשורה קשר הדוק לפעילות עצבית מקומית, טכניקה זו מאפשרת מיפוי תלת-ממדי של המוח כולו של הפעלה אזורית הנגרמת על ידי משימות, כמו גם קישוריות תפקודית של מצב מנוחה, באופן לא פולשני, עם רזולוציה מרחבית-זמנית ללא תחרות ופשטות תפעולית. בהשוואה ל- fMRI (הדמיית תהודה מגנטית תפקודית), יתרון עיקרי של הדמיית fUS מורכב מהפעלת תאימות מלאה לניסויים בבעלי חיים ערים ומתנהגים. יתר על כן, מיפוי המוח fMRI בעכברים, המודל הקדם-אקליני הנפוץ ביותר במדעי המוח, נותר מאתגר מבחינה טכנית בשל גודלו הקטן של המוח וקושי לשמור על מצבים פיזיולוגיים יציבים. כאן אנו מציגים פרוטוקול פשוט, אמין וחזק להדמיית fUS של המוח כולו בעכברים מרדים וערים באמצעות מערכת fUS מסחרית מדף עם מתמר ליניארי ממונע, המניב הפעלה קליפת המוח משמעותית בעקבות גירוי חושי, כמו גם דפוס קישוריות פונקציונלי 3D לשחזור לזיהוי רשת.
Introduction
בשני העשורים האחרונים, דימות מוחי הפך לכלי חשוב לחקר תפקוד המוח וארגון, המאפשר לחוקרים לגלות תגליות חשובות בתחום מדעי המוח. כיום, הדמיית תהודה מגנטית תפקודית (fMRI) הפכה לטכניקת הדמיית המוח הקלינית הסטנדרטית לזהב להערכת משימה או הפעלת מוח מעוררת סמים ומיפוי קישוריות תפקודית במנוחה. בעוד fMRI אנושי יש אמינות גבוהה ורגישות, fMRI עכבר נשאר מאתגר מבחינה טכנית מסיבות רבות1. ראשית, fMRI יש רזולוציה מרחבית וטמפורלית ירודה. הגודל הקטן של מוח העכבר מחייב שימוש בשדות מגנטיים חזקים באמצעות סורקים יקרים כדי להשיג רזולוציה מרחבית סבירה. שנית, שמירה על פרמטרים פיזיולוגיים יציבים בטווח הצר המאפשר צימוד נוירו-וסקולרי יעיל קשה מאוד בעכברים מרדים. לבסוף, רמת החמצן בדם תלויה (BOLD) אות שעליו מחקרי fMRI מסתמכים יש רגישות ירודה יחסית, המוביל יחס אות לרעש נמוך כאשר מוחל על עכברים ולעתים קרובות דורש הצגת גירוי חוזר על פני רכישה ארוכה כדי לזהות וריאציות קטנות. העכבר הוא המודל החייתי הנפוץ ביותר במחקר פרה-רפואי ביו-רפואי, מגבלות אלה אחראיות בחלקן לפער התרגומי בנוירופסיכיאטריה, ומעכבות מטרות טיפוליות מבטיחות חדשות על הספסל שיוחזו לטיפולים יעילים על המיטה.
אולטרסאונד פונקציונלי (fUS) היא טכניקת הדמיה מוחית שפותחה לאחרונה המבוססת על דופלר אולטרה מהיר2. על ידי דגימה ישירה של נפח הדם במוח, טכניקה זו מאפשרת לחטט בפעילות המוח בזמן אמת באמצעות צימוד נוירווסקולרי. בהשוואה לטכניקות דימות מוחי אחרות, fUS מניב רזולוציה מרחבית של 100 מיקרומטר ורזולוציה זמנית בעשרות אלפיות השנייה. טכניקה זו מאפשרת הדמיה מוחית שלמה של חלקים קורונל שלם של מוח העכבר, לגמרי לא פולשני. יתר על כן, הוא תואם לחלוטין עם בעלי חיים מודעים ומתנהגים3,4,5. אחת המגבלות הנוכחיות העיקריות של fUS היא התכונה הדו-פעמית שלה, המאפשרת להקליט מטוס קורונל יחיד בו זמנית. בעוד נפח 3D fUS באמצעות מתמרים מערך מטריצה 2D כבר הוכח בהצלחה בחולדות6 ואושר בעכברים7, חוסר הרגישות הנוכחי שלה דורש גולגולת מלאה, כמו גם ממוצע מספר חשוב של ניסויים כדי לזהות שינוי קל של פעילות. לחלופין, ניתן לדרוך על מתמרים ליניאריים על פני עמדות מרובות ולבצע הדמיה תפקודית מישור אחר מטוס כדי לכסות את כל המוח. עם זאת, טכניקה זו דורשת חזרות פרדיגמה ניסיוניות רבות וכזמן רכישה ארוך כזה (3-4 שעות למוח העכבר)8,9.
בעבודה הנוכחית, אנו מתארים פלטפורמה ניסיונית חזקה הכוללת סורק אולטרסאונד פונקציונלי זמין מסחרית ומתמר ליניארי מהיר מיתוג מטוס עם נהלים לרכישת נתוני fUS 3D בעכברים מורדמים וערים, המאפשר מיפוי פונקציונלי נפחי ותפקודי transcranial של מוח העכבר, לא פולשני, ללא סוכן ניגודיות ובזמני רכישה קצרים. אנו ממחישים תכונה זו על ידי מיפוי הפעלת קליפת המוח הסומטו-סנסורית בעקבות גירוי שפם, כמו גם קישוריות תפקודית של מצב מנוחה. מלבד הכנה לבעלי חיים ואיסוף נתונים, אנו מתארים גם את ההליך להדמיה, רישום אטלס וניתוח של אותות fUS בזמן אמת.
Protocol
כל ההליכים המוצגים כאן בוצעו בהסכמה עם הוראת מועצת הקהילה האירופית מ-22 בספטמבר 2010 (010/63/UE) וועדת האתיקה המקומית שלנו (Comité d'éthique en matière d'expérimentation animale מספר 59, 'מרכז פריז וסוד', פרויקט #2017-23). עכברים בוגרים (זכר C57BL/6 Rj, גיל 2-3 חודשים, 20-30 גרם, ממעבדות Janvier, צרפת) שוכנו 4 לכלוב עם מחזור בהיר / כהה 12 שעות, טמפרטורה קבועה ב 22 °C (75 °F) וליביטום מזון ומים. לפני תחילת הניסויים, בעלי חיים מקבלים תקופת התאקלמות מינימלית של שבוע לתנאי הדיור.
1. הכנה לבעלי חיים להדמיית fUS מרדים
- הרדמה
- שקל את העכבר.
- הכן תערובת של קטמין קסילאסין ב 10 מ"ג / מ"ל ו 2 מ"ג / מ"ל, בהתאמה, מלוחים סטריליים. יש לנהל 0.2 מ"ל של פתרון קטמין/קסילסין תוך-איטרה-א-פריטון באמצעות מחט 26 מד ומזרק חד פעמי של 1 מ"ל. לאחר מספר דקות, מקם את החיה על המסגרת הסטריאוטקסית, ודא שהראש שטוח.
- לנהל נפח שני של הרדמה כדי להגיע מינון כולל של 100 מ"ג / קילוגרם קטמין ו 20 מ"ג / קילוגרם xylazine (לוקח את המינון הראשוני בחשבון).
הערה: הרדמה צריכה להימשך 1 שעות. כדי לשמור על סעד יציב במשך זמן רב יותר, להזריק 0.05 מ"ל של תערובת קטמין / קסיליזין כל 30 דקות תוך איפריטונית.
-
הכנה לבעלי חיים למפגש הדמיה מרדים
- החל משחה לעיניים (למשל, Ocry-Gel) על עיני העכבר כדי למנוע היווצרות קטרקט במהלך מפגש ההדמיה. גילחו את ראש העכבר באמצעות גוזם. יש למרוח קצת קרם דפילטורי ולשטוף לאחר מספר דקות. חוזרים על הפעולה עד שהשיער מוסר לחלוטין.
- הכנס סיכות תת עוריות בגפיים להקלטת אלקטרוקרדיוגרמה (אק"ג). מניחים ג'ל אולטרסאונד צנטריפוגות (1500 סל"ד, 5 דקות) על הראש.
- ניטור עומק ההרדמה במהלך כל תקופת הניסויים (אינדוקציה הרדמה כלולה). לשמור על הטמפרטורה של בעלי החיים ב 37 °C (50 °F) באמצעות שמיכת חימום בשילוב בדיקה רקטלית.
- נטר את הפרמטרים הפיזיולוגיים הבאים שהם אינדיקטורים עקיפים לעומק ההרדמה: קצב הלב (220-250 פעימות לדקה - מנוטר באמצעות האלקטרו-לב האלקטרוגרם דק אלקטרודים מושתלים תת עורית), וקצב נשימה (130-140 נשימות לדקה - מנוטר באמצעות ספירומטר המחובר למערכת רכישת האק"ג).
הערה: תיאור ההתקנה הניסיונית מתואר באיור 1.
איור 1: התקנה ניסיונית לניסויי fUS מרדים. תיאור ההתקנה הניסיונית המציגה את כל הציוד המדעי הדרוש במהלך ניסוי מרדים. 1. ניטור פיזיולוגי : תצוגה חיה של תדרי הנשימה והיב. 2. מודול מנוע ארבעה צירים (שלושה תרגומים וסיבוב אחד) מנוטר על ידי מערכת Iconeus One (9) ומאפשר לבצע סריקות טומוגרפיות תלת-ממדיות טרנס-קדנציאליות או רכישות 4D. 3a. סרוו-מוטור המניע את ממריץ השפם(3b.) מנוע הסרוו נשלט על ידי כרטיס arduino uno אשר מתממשק עם מערכת Iconeus One (9) על מנת לסנכרן דפוסי גירוי עם רצפי הדמיה. 4.א. בקר משאבת מזרק. 4.b. מחזיק מזרק. 5.א. צג צלחת טמפרטורה השולט בצלחת החימום. 5.b. צלחת חימום ומדחום רקטלי ממשק עם צג צלחתהטמפרטורה (5.a.). 6. ג'ל אולטראסאונד ממוקם בין ראשו של בעל החיים לבין בדיקת אולטרסאונד, מתן צימוד אקוסטי ביניהם. 7. 15 MHz בדיקת אולטרסאונד. 8. מחזיק בדיקה המקשר את הגשוש (7) למודול המנוע (2). 9. Iconeus One ציוד ותוכנה, המאפשרים תכנות רצפי הדמיה שונים ושליטה במודול המנועים (2) המניע את הגשוש (7). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
2. הכנה לבעלי חיים לניסויי עכברים ערים
- ניתוח לוחית ראש
- מניחים את החיה המהממת (שלבים 1.1-1.2) במסגרת הסטריאוטקסית על כרית חימום (37 °C (37 °C). החל ג'ל מגן על העיניים ולנהל לידוקאין s.c. (0.2 מ"ל, 2 %) מתחת לעור הקרקפת באמצעות מחט 26-מד ולחכות כמה דקות.
הערה: לפקח על רמת ההרדמה כל 10-30 דקות על ידי תגובה (היעדר) לצביטת בוהן מוצקה. - בצע חתירה בעקבות תפירת הקשת מאחורי העצם העורפית לתחילת עצם האף. באמצעות מספריים כירורגיים, excise העור על שתי ההמיספרות.
- נקה את הגולגולת עם תמיסת יוד 1% ולהסיר כל periosteum הנותרים. באמצעות לוחית הראש כתבנית, לקדוח שני חורים (קוטר 1 מ"מ) בגולגולת כדי למקם את ברגי העיגון.
זהירות: היזהר לא לקדוח לחלוטין דרך הגולגולת כדי למנוע נזקים מוחיים או דלקת דורה - מקם את לוחית הראש עם הברגים. השתמש במלט דנטלי כדי לתקן את הברגים ואת לוחית הראש מלפנים ובחלק האחורי של המסגרת כדי לשמור על אחיזה טובה של השתל.
אזהרה: היזהר לא להחיל מלט בתוך חלון המסגרת כפי שהוא מקטין מאוד את איכות האות. לכסות את הגולגולת עם שכבה דקה של דבק כירורגי כדי להגן על העצם ולאטום את הפצעים בצד של חלון ההדמיה. - הסר את החיה מן המסגרת סטריאוטקסית לאחר המלט יבש ולהפוך את ההרדמה על ידי זריקה תת עורית של atipamezole ב 1 מ"ג / קילוגרם. ניהול מניעתי של meloxicam (5 מ"ג/ קילוגרם / יום, s.c.) מנוהל עבור כאב לאחר הניתוח.
- מניחים את החיה בכלוב התאוששות על כרית חימום (37 מעלות צלזיוס). העכבר יכול להחזיר את הכלוב הביתי שלו עם המלטה בתוך כמה שעות. הניחו מכסה מגנטי בהדפסה תלת-ממדית (חומר חומצה פוליקטית עם תוספות מגנט) מעל לוחית הראש להגנה(איור 2A). השאירו את העכבר להתאושש במשך 4 עד 6 ימים לפני תחילת ההרגל לכלוב הבית הנייד (MHC).
הערה: המשקל הכולל של המכסה ואת לוחית הראש הוא 2.8 גרם.
- מניחים את החיה המהממת (שלבים 1.1-1.2) במסגרת הסטריאוטקסית על כרית חימום (37 °C (37 °C). החל ג'ל מגן על העיניים ולנהל לידוקאין s.c. (0.2 מ"ל, 2 %) מתחת לעור הקרקפת באמצעות מחט 26-מד ולחכות כמה דקות.
- טיפול והרגלה
- ביום 1 לאחר ההתאוששות (יח"צ), יש להחזיק בעדינות את העכבר ביד למשך 5-10 דקות מספר פעמים ביום.
- ביום 2 יחסי ציבור, טיפול חוזר כמו ביום 1 ולהשאיר את החיה במשך 5 - 10 דקות לחקור בחופשיות MHC.
הערה: השמעת מוזיקת רקע בחדר יכולה לעזור להפחית את הלחץ של בעלי החיים. - ביום 3 יחסי ציבור, תן לחיה לחקור בחופשיות את MHC במשך 5 - 10 דקות. לאחר מכן, לתפוס בזהירות את לוחית הראש בעדינות למקם אותו מהדק, נע באופן ידני כלוב הפחמן ללוות את העכבר. להרגיל את החיה במצב ראש קבוע במשך 5-10 דקות. נקו את ה-MHC בין אימונים עם תמיסת אתנול 70% ושטפו במי ברז.
הערה: ודא כי MHC מקבל זרימת אוויר מספקת כפי שהומלץ על ידי היצרן. יש לכוונן ידנית את גובה מהדק הראש כדי לספק תנוחה נוחה. - ביום 4 ו 5 יחסי ציבור, להדק שוב ושוב את העכבר MHC ולהגדיל בהדרגה את הזמן קבוע הראש, החל מ 5 דקות ועד 30 דקות. החל כמה מלוחים וג'ל אולטרסאונד על חלון ההדמיה כדי להרגיל.
- ביום 6 יחסי ציבור, חזור על הפרוטוקול מיום 4/5 יחסי ציבור והצב את הגשוש מעל ראשו של בעל החיים לאחר שלב 3.1.
- ביום הניסוי, המשך כמתואר לעיל. לאחר מכן, לח את חלון ההדמיה עם תמיסת מלח ולהחיל קצת ג'ל אולטרסאונד. התחל את המעקב אחר החיה והמשיך למיקום הגשוש (ראה להלן).
הערה: הידוק ב- MHC יכול להיעשות גם על ידי עטיפת העכבר בסמרטוט. במקרה זה, עכברים צריכים להיות רגילים להליך העטיפה לפני קיבוע הראש. תיאור של התקנה ניסיונית מלאה להדמיה ערה מסופק באיור 2B.
איור 2: התקנה ניסיונית לניסויים ערים של fUS. א. איור סכמטי של הכיסוי המגנטי של לוחית הראש המגן על חלון ההדמיה (שנוצר באמצעות BioRender.com). במהלך מפגשי הדמיה (משמאל), הכיסוי מוסר כדי לסרוק את המוח בצמצם הגדול המוצע על ידי צלחת הראש. ב. צילום של ההתקנה הניסיונית להדמיה ערה טרנס-ת עורית בעכברים שמתנהגים בחופשיות. 1. מערכת ותוכנה Iconeus One, המאפשרת להגדיר רצפי הדמיה שונים ולשלוט במודול המנועים. 2. מודול מנועים ארבעה צירים (שלושה תרגומים וסיבוב אחד) מנוטר על ידי מערכת Iconeus One (1)ומאפשר סריקות טומוגרפיות תלת-ממדיות או רכישות 4D. 3. שולחן חלוקת אוויר. 4. כלוב ביתי נייד (MHC). 5א,5b. תצלומים המציגים נופים קרובים יותר של סביבת החיה בתוך MHC. 6. מערכת קיבוע הראש מהדקת את צלחת הראש. 7. מחזיק בדיקה המקשר את הגשוש למודול המנוע (2). 8.15 MHz בדיקה קולית. 9. ג'ל אולטראסאונד ממוקם בין ראש העכבר לבין בדיקת אולטרסאונד, מתן צימוד אקוסטי ביניהם. 10. סרוו-מוטור נוהגת ממריץ השפם. מנוע הסרוו נשלט על ידי כרטיס Arduino Uno אשר מתממשק עם מערכת Iconeus One באמצעות אות TTL (1) על מנת לסנכרן דפוסי גירוי עם רצפי הדמיה. ג. איור של אפשרויות הדגימה המרחביות השונות (שנוצרו עם BioRender.com): בכל מקרה, הבדיקה מדורגת מהמיקום הראשון לאחרון ותמונת דופלר נרשמת בכל מיקום כדי לשחזר את עוצמת הקול הערומה. תהליך זה חוזר על עצמו ברציפות במהלך כל זמן הרכישה. סריקה צפופה (משמאל): השלב בין פרוסות חייב להיות קטן מספיק (בדרך כלל 400 מיקרומטר, התואם לרזולוציית הגובה) כדי לאפשר הדמיה נפחית. סריקה דלילה (מימין): אם אזורים פונקציונליים מרוחקים ממוקדים (במיקומים שונים), ניתן גם להקטין את הדגימה המרחבית כדי לדמיין פרוסות שונות המצטלבות באזורים אלה מבלי להתפשר על הדגימה הטמפורלית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
3. מיקום בדיקה
- הפעל את התוכנה (למשל, IcoScan) וצור הפעלת ניסוי. עבור לתפריט הזזת בדיקה כדי להתאים את המיקום של בדיקה אולטרסאונד באמצעות מקלדת הניווט.
הערה: הגשוש צריך להיות ממוקם כ 1 מ"מ מעל ראשו של החיה. זה חיוני כדי להבטיח כי הבדיקה היא במגע עם ג'ל אולטרסאונד לפני תחילת כל רצף הדמיה. - התחל את רכישת Live View והתאם את מיקום הבדיקה במידת הצורך באמצעות הדמיה בזמן אמת של CBV החיה (נפח דם מוחי). ישר את המוח במרכז התמונה. מטב את פרמטרי ההדמיה כדי ללכוד את יחס האות לרעש הגבוה ביותר.
הערה: בניסויים בעכברים ערים, יש להפחית את גודל הצמצם כדי למנוע חפצים הנגרמים על ידי התכווצות שרירים לרוחב.
4. סריקה אנגיוגרפית ורישום אטלס
- פתח את האפשרות 3D אנג'יו בתוכנת הרכישה. בחלונית המוגדרת מראש, התאימו את פרמטרי הסריקה (הפרוסה הראשונה, הפרוסה האחרונה וגודל הצעד) כדי לסרוק את כל המוח(איור 3A,B)ולהתחיל את הרכישה.
הערה: בעת הגדרת פרמטרי הסריקה, ודא כי הסריקה תכסה את החלק האחורי של המוח - השאר את תוכנת הרכישה פתוחה והתחל את התוכנה לניתוח נתונים ופריטים חזותיים (לדוגמה, IcoStudio), וטען את סריקת האנgio 3D. נווט בנפח הרכישה באמצעות החלונית עם 3 תצוגות ובחר את כיוון הסריקה של קורנל: antero-אחורי או אחורי- הקדמי.
- עבור אל לוח רישום המוח. טען את תבנית הפניית העכבר שתידרש עבור תהליך הרישום. רשום את הסריקה במסגרת הקואורדינטות המשותפות של אלן עכבר באמצעות מצבי הרישום האוטומטיים או הידניים במלואם (איור 3C).
- בדוק את התוצאה על ידי התבוננות במיקום העל של סריקת אנגיו תלת-ממד ותבנית הייחוס או על ידי התבוננות במיקום העל של הסריקה ובאטלס הייחוס של אלן באמצעות החלונית Atlas Manager (איור 3D). שמור את הרישום כקובץ .bps
הערה: ניתן לעשות שימוש חוזר בקובץ הרישום עבור כל רכישה אחרת שבוצעה במהלך אותה הפעלת ניסוי.
5. מערכת מיקום המוח (BPS)
- בתוכנת IcoStudio, ודא כי הסריקה אנגיוגרפית וקובץ .bps שלה (שנוצר בשלב 4.4) נטענים.
- עבור אל לוח הניווט במוח. בחלונית Atlas Manager, נווט דרך אטלס המוח של אלן העכבר עם נווט עץ האב/ילד. מצא את האזורים הממוקדים האנטומיים ובחר אותם כדי להנחית אותם לסריקה שלך ב-3 התצוגות.
- דמיינו את האזורים המיועדים בחלונית בעלת 3 הצפייה ובחרו מישור הדמיה החופף לאזורים המיועדים לניסוי. כדי לעשות זאת, הגדר ידנית שני סמנים על העמדה קורונל הכוללת את אזורי העניין.
- לחץ על מערכת מיקום המוח (BPS) כדי לחלץ את הקואורדינטות המוטוריות המתקבלות. קואורדינטות אלה תואמות את מיקום הגשושית המאפשרת לדמות את המטוס הממוקד. בדוק את התצוגה המקדימה של התמונה אשר מחושבת מתוך סריקת אנגיו.
- בתוכנת IcoScan, הזן את לוח מיקום הבדיקה ולחץ על הזן קואורדינטות BPS. החל את הקואורדינטות שניתנו בשלב 5.4. הגשושית נעה ומתיישרת במישור ההדמיה הממוקד.
- בצע רכישה של תצוגה חיה ובדוק שמישור ההדמיה הנוכחי תואם לתחזית שניתנה בשלב 5.4.
הערה: ניתן גם לבחור מישורים חמסתיים/לא אורתוגונליים.
איור 3: סריקה אנגיוגרפית טרנס-ת-ת-גיאוגרפית מהירה ורישום מוח למיקום מדויק של בדיקה. א. ייצוג סכמטי של מוח העכבר נסרק באופן טרנסקרני על ידי הבדיקה הקולית מהפרוסה הראשונה (ירוקה) לפרוסה האחרונה (כחולה) במהלך סריקה אנגיוגרפית מהירה. הפרוסה הנוכחית (המיוצגת באדום) נעה צעד אחר צעד מהגב (ירוק) לחזית (הכחולה) של המוח. נוצר עם BioRender.com B. צילום מסך של תוכנת הרכישה IcoScan בלוח 3D אנג'יו. הפרמטרים המוגדרים מראש בצד ימין קובעים את תצורת הסריקה המהירה. המיקומים במ"מ של הפרוסה הראשונה, הפרוסה האחרונה וגודל הצעד חייבים להיות נבחרים היטב כדי לסרוק באופן ליניארי את כל המוח. ג. צילום מסך של תוכנת העיבוד IcoStudio. סריקת 3D אנגיו המהירה נרשמת באופן אוטומטי לתבנית ייחוס של מוח העכבר. שלוש התצוגות (משמאל) מציגות את מיקום העל של כלי הים ואת מוח העכבר אלן אטלס בתצוגות קורונליות, קשתיות וציריות. ד. פריסה ליניארית (מונטאז') של 16 פרוסות (מתוך 31) וסריקת אנגיו תלת-ממדית, כאשר אטלס הייחוס הרשום של אלן מונח על גבי כלי היתווה. אי. צילום מסך של לוח הניווט במוח המציג את מישור ההדמיה החזוי המתאים לקואורדינטות המנוע שחושבו על ידי התוכנה הודות לשני הסמנים הממוקמים במרכז קליפת המוח הסומטוסנסורית הראשית השמאלית והימנית, אזור שדות חבית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
6. ניסוי מעורר משימה: גירוי שפם
- קדם להגדיר את רצף הגירוי, כולל זמן של גירוי, זמן גירוי בין ומספר חזרות.
- הפעל רצף fUS תלת-ממדי על-ידי הגדרת זמן הרכישה הכולל, מספר הפוזיציות וכן זמן המת בין עמדות. במקרה של גירוי אוטומטי המסונכרן עם מערכת הרכישה באמצעות קלט TTL, בחר באפשרות טריג-IN לפני תחילת הרכישה.
הערה: לקבלת התוצאות המוצגות בעבודה זו, גירוי נמסר באמצעות צמר גפן ממוקם כגון כדי לאפשר הסטה של רוב השפם בכיוון גחון/ גחון. הוא תוקן על מנוע סרוו מונע על ידי כרטיס ARDUINO UNO, מקושר למערכת Iconeus One כדי להבטיח סנכרון. הפרמטרים המומלצים לגירוי הם 30 s ON, 30 s OFF, משרעת של תדר 20° ו 4 הרץ. לחלופין, הגירוי יכול גם להימסר באופן ידני על ידי הסטת השפם בזמנים המוגדרים במהלך הרכישה. - פתח את הרכישה בתוכנת IcoStudio והזן את תפריט מפת ההפעלה. מלא את שדה תבנית ההפעלה בזמני התחלה וסיום וחשב את מפת ההפעלה. התאם את פרמטרי התצוגה עבור פריט חזותי. יצא את מפת ההפעלה כקובץ .h5 לניתוח לא מקוון.
הערה: ההפעלה מוערכת באמצעות גישה כללית של מודל ליניארי (GLM) כאשר הגירוי סובב בתגובה המודינמית (HRF) המוגדרת כברירת מחדל של העכבר. לחלופין, ניתן לדמיין את ההפעלה ישירות על-ידי הערכת מתאם פירסון בין תבנית הגירוי לבין האות המודינמי מכל ווקסל.
7. קישוריות פונקציונלית 4D
- הפעל רצף fUS תלת-ממדי על-ידי הגדרת זמן הרכישה הכולל, מספר עמדות מטוס ההדמיה וכן זמן המת בין עמדות.
הערה: עבור קישוריות פונקציונלית 4D, אנו ממליצים על זמן רכישה בין כל אמצעי אחסון < 2.5 s (תדירות דגימה של לפחות 0.4 הרץ) וזמן רכישה כולל של לפחות 10 דקות (מספר נקודות זמן > 180). - שמור את הרכישה וטען אותה בתוכנת IcoStudio. במידת הצורך, טען את קובץ ה- .bps ואת מסגרת קואורדינטת המוח של העכבר אלן. במנהל האטלס, בחר אזורים של האטלס כאזורים בעלי עניין (ROI).
- הזן את תפריט קישוריות פונקציונלית ובחר את האזורים הרצויים במנהל ההורא/י. הצג את התוצאות כמטריצת קישוריות (ניתוח מפוקח) או כמפת מתאם מבוססת זרעים (ללא פיקוח). בחר והתאם את מסנני רוחב הפס לפי הרצוי וייצוא תוצאות מתאם לניתוח סטטיסטי.
הערה: במצב הדמיה תלת-ממדי fUS, עמדות הבדיקה היחסיות מוגדרות באופן ידני. לפיכך, שני סוגים של סריקות אפשריים וניתן לבחור בהתאם ליישום הפונקציונלי: סריקות צפופות לעומת סריקות דלילות (איור 2C).
Representative Results
פרוטוקול זה מתאר את הכימות 3D של וריאציות המודינמיות מוחיות באופן טרנסקרטי במוח העכבר, במנוחה או בתגובה לגירוי חושי. גירוי שפם, פרדיגמה סטנדרטית למיפוי הפעלה תפקודית של המוח במכרסמים, נבחרה כדוגמה לתגובה מעוררת גירוי חושי. איור 4 מציג מפת הפעלה מייצגת בתגובה לגירוי שפם מכני בעכבר מרדים המתקבל באמצעות הדמיית fUS transcranial. זמן הניסיון הכולל היה 760 s, עם בסיס של 60 s (לפני ואחרי הגירוי), גירוי של 80 s וזמן התאוששות של 60, חזר על עצמו 5x. הפעלה משמעותית נקבעה ברזולוציה של מודל ליניארי כללי (GLM) באמצעות פונקציית תגובה המודינמית (HRF) המשמשת כברירת מחדל. האזורים המופעלים (ציוני Z עם ערך p >0.0000006 לאחר תיקון Bonferroni מחמיר להשוואה מרובה) מוצגים כערכים מקודדים בצבע מעל לתבנית מסגרת הקואורדינטות המשותפת של אלן. מהלך הזמן מבחינת Voxel של קליפת המוח הסומטו-סנסורית העיקרית הנגדית, אזור שדה החביות (S1BF) חשף עלייה של 15%-20% ב- CBV בהשוואה לבסיס.
איור 4: מפות הפעלה טרנס-תברתית וקורס זמן rCBV בעקבות גירוי שפם בעכבר מרדים קטמין/קסילסילאזין. א. מפת הפעלה המציגה ווקסלים המופעלים באופן משמעותי בעקבות גירוי מכני של השפם הימני (80 s ON, 60 s OFF ,5x) תחת הרדמה קטמין/קסילסילאזין. מפות הושגו על ידי חישוב ציוני Z בהתבסס על ניתוח מודל ליניארי כללי (GLM) עם תיקון Bonferroni להשוואה מרובה. ציוני Z (מקודדים בצבע) מכוסים בתבנית תלת-ממד של המוח של אלן (לאחר הרישום במערכת מיקום המוח) ומוצגים בשלוש תצוגות: קורונל (משמאל), קשתית (באמצע) וציר (מימין). אזורים אנטומיים ממסגרת הקואורדינטות הנפוצה של מוח העכבר אלן מוצגים לעיון. voxels מופעל ממוקמים היטב בתוך קליפת המוח השמאלית S1BF. מוט קנה מידה: 1 מ"מ. כל נפח דגימה נסרק מעל 2.8 מ"מ (המקביל ל-7 פרוסות בכיוון הגובה) ב-3.85 s, מה שמאפשר לרשום 20 דגימות וולומיות במהלך כל תגובה פונקציונלית. B. עיבוד תלת-ממדי של גירוי שפם-מעורר נפח דם מוחי יחסי (rCBV) עלייה בהשוואה לרמה הבסיסית. התיוג האנטומי של ה- S1BF מצוין בכחול. ג. קורס זמן של וריאציות CBV ב- S1BF השמאלי (כחול) ובגירוי המתאים מוחל (אדום). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
אותה פרדיגמה הוחלה בעכבר שמתנהג קבוע בראשו בבית הנייד באמצעות הקביעה המוגדרת מראש של IcoScan. איור 5 מציג את מפת ההפעלה לאחר ניסוי גירוי שפם מרובה באמצעות ההתקנה הניסיונית המתוארת באיור 2. כמה שפם אחורי וקדמומי עורר את התבנית הבאה: 30 s בסיסי ואחריו חמישה ניסויים רצופים של 30 s ON (4 הרץ) ו 30 s OFF (איור 5C). גירוי נמסר באמצעות מנוע סרוו מונע על ידי כרטיס Arduino UNO המפעיל את רצף רכישת התמונה לסינכרון. הפעלה משמעותית נקבעה ברזולוציה של מודל ליניארי כללי (GLM) באמצעות פונקציית תגובה המודינמית (HRF) המשמשת כברירת מחדל. בוצע תיקון השוואה מרובה בשיטת Bonferroni. רמת אלפא קונבנציונלית של 0.05 נרמלה על ידי המספר הכולל של voxels בנפח הרכישה, וכתוצאה מכך סף מחמיר סופי של 0.000003.
איור 5: מפות הפעלה וקורס זמן rCBV בעקבות גירוי שפם בעכבר שהתנהג ער. א. מפת הפעלה המציגה voxels מופעל באופן משמעותי בעקבות גירוי מכני של השפם הימני (30 s ON, 30 s OFF, 5x) בעכבר ער בבית הנייד. מפות הושגו על ידי חישוב ציוני Z בהתבסס על ניתוח מודל ליניארי כללי (GLM) עם תיקון Bonferroni להשוואה מרובה (נורמליזציה במספר הכולל של voxels). ציוני Z (מקודדים בצבע) מכוסים בתבנית תלת-ממד של המוח של אלן (לאחר הרישום במערכת מיקום המוח) ומוצגים בשלוש תצוגות: קורונל (משמאל), קשת (אמצע) וסיקסי (מימין). אזורים אנטומיים ממסגרת הקואורדינטות המשותפת של המוח של אלן עכבר מוצגים לעיון. voxels מופעל ממוקמים היטב בתוך קליפת המוח השמאלית S1BF. מוטות קשקשים, 1 מ"מ. כל נפח מדגם נסרק מעל 1.6 מ"מ (המקביל ל-3 פרוסות בכיוון הגובה) ב-3.85 s המאפשר לרשום 17 דגימות נפחיות במהלך כל תגובה פונקציונלית. ב. עיבוד תלת-ממדי של גירוי שפם-מעורר נפח דם מוחי יחסי (rCBV) עלייה בהשוואה לרמה הבסיסית. התיוג האנטומי של ה- S1BF מצוין בכחול. ג. איור של העכבר בבית הנייד במהלך ניסוי גירוי השפם הנכון, שבמהלכו בוצעו חמישה ניסויים של 30 s לזמן רכישה כולל של 330 s. D. קורס זמן CBV יחסי מיידי שחולץ בתוך האזור הפעיל (כחול), עם הגירוי המתאים על גבי (אדום). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6 מציג את המתאם הזמני של תנודות CBV ספונטניות בתדר נמוך (<0.2 הרץ) בין אזורי מוח תלת-ממדיים (שזוהו מרישום למסגרת הקואורדינטות המשותפת של אלן) בעכבר מרדים קטמין-קסילסין. זמן הרכישה הכולל היה 20 דקות (1200 s). ניתוח בפיקוח אטלס גילה דפוסי קישוריות בין-הומיספיריים חזקים, וערכי מקדם המתאם וכתוצאה מכך הם עד 0.8. ניתוח מבוסס זרעים בהיפוקמפוס האחורי גילה קישוריות בין-הומיספירית משמעותית בין היפוקמפוס ימני ושמאלי, כמו גם אזורי רטרו-היפוקמפוס עמוקים וקורטיז פיריפורם. אזור זרע שנבחר ב- S1BF הביא גם לתבנית מתאם סימטרית (קורטיקו-קליפת המוח), כפי שתואר בעבר.
איור 6: קישוריות תפקודית של מצב מנוחה נפחית טרנס-cranial של מוח העכבר תחת הרדמה קטמין/קסילן מוערך על רכישת fUS 20 דקות 3D. א. מטריצת מתאם המבוססת על אזורי תלת-ממד של מסגרת הקואורדינטות המשותפת של אלן הרשומה ברכישה התפקודית הטרנס-ת-חנקתית. המטריצה מתקבלת על ידי חישוב המתאם של פירסון מנורמל של תנודות ספונטניות בתדר נמוך (<0.1 הרץ) של אותות הזמן הממוצעים מכל voxels הכלולים בכל ROI מזוהה לאחר תיקון תזמון פרוסה. כל נפח שנדגם נסרק מעל 1.6 מ"מ בכיוון הגובה (המקביל ל -4 פרוסות) שנרכשו מעל 2.2 s. B. ניתוח מבוסס זרעים המוקרן על תבנית תלת-ממד. הזרע נבחר בתוך ההיפוקמפוס הימני בגובה β - 2.1 מ"מ. מפת המתאם מתקבלת על ידי חישוב מקדם המתאם פירסון בין אותות הזמן של הזרע לבין כל ווקסל של הרכישה כולה לאחר תיקון תזמון פרוסה. ג. מפת מתאם תלת-ממדית המבוססת על ניתוח מבוסס זרעים עם אזור זרעים שנבחר בתוך ה-S1BF ב-β - 2.1 מ"מ. מוטות קנה מידה: 1 מ"מ. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Discussion
שיטות הדמיה מוחיות שלמות הן כלים חיוניים להבנת פיזיולוגיה ופתולוגיה של המוח טוב יותר. השיטה המתוארת כאן מאפשרת כימות מדויק של אותות המונמיים במוח החי ישירות על הספסל. הרגישות ללא תחרות ורזולוציה spatio-temporal של אולטרסאונד פונקציונלי מתאים במיוחד עבור פיזיולוגיה העכבר. ניתן למפות תגובות פונקציונליות ורשתות מצב מנוחה בתוך זמני רכישה קצרים, לאורך וללא צורך בממוצע ניסויים או נושאים כדי להשיג מידה אמינה. השילוב הרלוונטי של בדיקות ליניאריות קוליות רגישות גבוהה והגדרות ממונעות מהירות מאפשר לבצע הדמיה fUS נפחית transcranial בעכברים בתוך זמני רכישה סבירים. פרוטוקול זה יכול להתבצע על עכברים מרדים או ערים באמצעות כלוב ביתי נייד.
גירוי שפם, הגירוי החושי המשמש כדוגמה להמחשה בכתב יד זה, הוא פרדיגמת הפעלה פונקציונלית סטנדרטית במכרסמים וקריאה אמינה לחקר עיבוד חושי, צימוד נוירווסקולרי ושינויים5,6,10,11. בעוד צחצוח ידני גס של השפם עשוי להיות מועדף על קלות השימוש שלה, שיטה זו חסרה דיוק מרחבי וטמפורלי. השימוש ממריץ אוטומטי, כגון זה המתואר כאן מופעל עם סורק הדמיה fUS, מאפשר שליטה טובה יותר של מספר פרמטרים כולל זמן תחילת, עקירת משרעת, התדירות, כמו גם את הזווית של Q-tip / מסרק, וכתוצאה מכך רבייה בין בעלי חיים טובה יותר. בנוסף, תזמון מדויק יותר של גירוי מאפשר מידול של פונקציית התגובה המודינמית (HRF) על ידי קביעת הזמן להתפרצות וזמן לשיאפרמטרים 12,13. כדי להבטיח דיוק טוב יותר במספר השפם שהוסטה במהלך הגירוי (וכך את אזור האזור המופעל), ניתן להתאים ממריצים מתוחכמים יותר לפרוטוקול זה. גירויים רבים אחרים כגון אור8, צליל14 או מצגת ריח15 ניתן ליישם באמצעות אותו פרוטוקול.
התאימות של אולטרסאונד פונקציונלי עם בעלי חיים ערים ומתנהגים היא יתרון חשוב בהשוואה לטכניקות דימות מוחי אחרות, המאפשרות מיפוי הפעלה פונקציונלי ללא הטיית ההרדמה. שימוש במכלאה ניידת מורמת אוויר היא חלופה טובה למנגנונים קיימים אחרים עם תיקון ראש, כגון הליכונים ליניאריים או כדוריים. תוך תיקון ראש בחוזקה, התנועה של הבית נותן לעכבר את האשליה לנווט בסביבה, ומאפשר מגוון רחב של בדיקות התנהגותיות להיות מצמידים הדמיה fUS16. עם זאת, הליך ההרגלה לתיקון ראש מהווה צעד חשוב להפחתת הלחץ, במיוחד עבור ניסויים שבהם זה יכול להיחשב גורם מבלבל. ההליך המפורט כאן (6 ימים של טיפול והרגל לקיבוע ראש) נותן תוצאות חזקות לגירוי חושי וקישוריות תפקודית של מצב מנוחה. עם זאת, ייתכן שיהיה צורך להאריך את תקופת ההרגלה לבדיקות התנהגותיות מעודנות יותר17.
Disclosures
ג'רמי פרייר וברונו-פליקס אוסמנסקי הם עובדי איקוניוס. תומאס דפיו, זולט לנקי, ברונו-פליקס אוסמנסקי ומיכאל טנטר הם מייסדים ובעלי מניות משותפים של Iconeus.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מועצת המחקר האירופית (ERC) מענק מתקדם N° 339244-FUSIMAGINE, הסוכנות הלאומית למימון מחקר 'קמצוץ' (ANR-18-CE37-005), מאיץ טכנולוגיות המחקר של Inserm באולטרסאונד ביו-רפואי, הליבה הטכנית של ElfUS של ה- IPNP, Inserm U1266, תוכנית המחקר האירופית FUSIMICE של פרויקט המוח האנושי, ומלגת EMBO לטווח קצר 8439 לאנדריאה קליוור.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Plastipak 1 mL syringes | Dutscher, France | 303172 | |
| BD Microlance 26 Gauge needles | Dutscher, France | 303800 | |
| Animal Temperature Controller (heating Plate coupled with a rectal probe) | Physitemp | TCAT-2DF | |
| Arduino | Arduino | Arduino Uno-Rev3 | |
| Atipamezole | Orion Pharma, France | Antisedan® | 5 mg/ml injectable solution |
| Dental Ciment | Sun Médical, Shiga, japan | Superbond C&B | |
| Depilatory cream | Klorane | N/A | |
| Eye Ointment | TVM, UK | Ocry-gel | |
| Hair trimmer | Wella Profesionnals | N/A | |
| Head plates | Neurotar, Finland | Model 14 | |
| Iconeus One standard package for fUS | Iconeus, France | Iconeus One | |
| IcoScan acquisition software (v1.0) | Iconeus, France | IcoScan | |
| IcoStudio analysis software (v1.0) | Iconeus, France | IcoStudio | |
| Isoflurane Anesthesia station | Minerve, Esternay, France | ||
| Ketamine | Virbac, France | Ketamine1000 | 100 mg/ml injectable solution |
| Lidocaine | Vetoquinol | Lurocaine® | 20 mg/ml injectable solution |
| Medetomidine | Orion Pharma, France | Domitor® | 1 mg/ml injectable solution |
| Meloxicam | Boehringer lingelheim | Metacam® | 0.5 mg/ml injectable solution |
| Mobile HomeCage Large with tracking capability | Neurotar, Finland | MHC-L-T-V4 | |
| Monitoring of ECG and breathing rate | AD Systems, (USA) and LabChart software | ||
| Servomotor | Feetech | FT90B | |
| Stereotaxic frame | David Kopf (Tujunga, USA) | 900-WA | Using Mouse Adaptor (Ref: 922) and Non-Rupture Ear Bars (ref: 922) |
| Surgical glue | 3M, USA | Vetbond | |
| Syringe Pump | KD Scientific, USA | Legato® 130, Cat# 788130 | |
| Ultrasound gel | DREXCO medical, France | Medi'Gel | |
| Xylazine 2% | Bayer, France | Rompun® | 20 mg/ml injectable solution |
References
- Hoyer, C., Gass, N., Weber-Fahr, W., Sartorius, A. Advantages and challenges of small animal magnetic resonance imaging as a translational tool. Neuropsychobiology. 69 (4), 187-201 (2014).
- Deffieux, T., Demene, C., Pernot, M., Tanter, M. Functional ultrasound neuroimaging: a review of the preclinical and clinical state of the art. Current Opinion in Neurobiology. 50, 128-135 (2018).
- Rabut, C., et al. Pharmaco-fUS: Quantification of pharmacologically-induced dynamic changes in brain perfusion and connectivity by functional ultrasound imaging in awake mice. NeuroImage. 222, 117231 (2020).
- Tiran, E., et al. Transcranial functional ultrasound imaging in freely moving awake mice and anesthetized young rats without contrast agent. Ultrasound in Medicine and Biology. 43 (8), 1679-1689 (2017).
- Ferrier, J., Tiran, E., Deffieux, T., Tanter, M., Lenkei, Z. Functional imaging evidence for task-induced deactivation and disconnection of a major default mode network hub in the mouse brain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (26), 15270-15280 (2020).
- Rabut, C., et al. 4D functional ultrasound imaging of whole-brain activity in rodents. Nature Methods. 16 (10), 994-997 (2019).
- Brunner, C., et al. A platform for brain-wide volumetric functional ultrasound imaging and of circuit dynamics in awake mice. Neuron. 108 (5), 861-875 (2020).
- Gesnik, M., et al. 3D functional ultrasound imaging of the cerebral visual system in rodents. NeuroImage. 149, 267-274 (2017).
- Macé, É, et al. Whole-brain functional ultrasound imaging reveals brain modules for visuomotor integration. Neuron. 100 (5), 1241-1251 (2018).
- Macé, E., Montaldo, G., Cohen, I., Baulac, M., Fink, M., Tanter, M.
- Tiran, E., et al. Transcranial functional ultrasound imaging in freely moving awake mice and anesthetized young rats without contrast agent. Ultrasound in Medicine and Biology. 43 (8), 1679-1689 (2017).
- Claron, J., et al. Large scale functional ultrasound imaging of the spinal cord reveals in depth spatiotemporal responses of spinal nociceptive circuits in both normal and inflammatory state. Pain. , (2020).
- Aydin, A. K., et al. Transfer functions linking neural calcium to single voxel functional ultrasound signal. Nature Communications. 11 (1), 2954 (2020).
- Bimbard, C., et al. Multi-scale mapping along the auditory hierarchy using high-resolution functional ultrasound in the awake ferret. eLife. 7, 35028 (2018).
- Boido, D., et al. Mesoscopic and microscopic imaging of sensory responses in the same animal. Nature Communications. 10 (1), 1110 (2019).
- Kislin, M., et al. Flat-floored air-lifted platform: A new method for combining behavior with microscopy or electrophysiology on awake freely moving rodents. Journal of Visualized Experiments. (88), e51869 (2014).
- Juczewski, K., Koussa, J. A., Kesner, A. J., Lee, J. O., Lovinger, D. M. Stress and behavioral correlates in the head-fixed method: stress measurements, habituation dynamics, locomotion, and motor-skill learning in mice. Scientific Reports. 10 (1), 12245 (2020).
