이 프로토콜은 성인 및 청소년 양 난모세포의 유리화를 위한 표준 방법을 제공하는 것을 목표로 합니다. 여기에는 시험관 내 성숙 미디어 준비부터 온난화 후 문화에 이르기까지 모든 단계가 포함됩니다. 난동체는 최소한의 필수 볼륨을 보장하기 위해 Cryotop을 사용하여 MII 단계에서 진동됩니다.
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이 논문에서
요약
초록
가축에서는 도살장에서 쉽게 얻을 수 있는 많은 수의 난소와 난소 로 인해 체외 배아 생산 시스템을 개발하고 지속할 수 있다. 성인 난소는 항상 여러 개 항성 여포를 부담, 전 사춘기 기증자에서 난소의 최대 수는 4 주에 사용할 수 있습니다, 때 난소는 개소 여포의 피크 번호를 곰. 따라서, 4 주 된 양은 좋은 기증자로 간주됩니다, 프레우버탈 난모세포의 발달 능력이 성인 대응에 비해 낮은 경우에도.
기본 연구 및 상업 응용 프로그램은 성인 및 프레우버탈 기증자 모두에서 얻은 유리화 된 난초를 성공적으로 냉동 보존 할 수있는 가능성에 의해 증폭 될 것입니다. 프레우버탈 기증자로부터 수집된 난소세포의 병리화는 또한 생성 간격을 단축하고 따라서 사육 프로그램에서 유전 이득을 증가시키는 것을 허용할 것입니다. 그러나, 동결 보존 후 발달 잠재력의 손실은 포유류 난모세포를 아마 냉동 보존하는 가장 어려운 세포 유형 중 하나를 만든다. 사용 가능한 냉동 보존 기술 중, 유리화는 동물과 인간의 난모세포에 널리 적용됩니다. 기술의 최근 발전에도 불구하고, 냉동 보호제의 고농도에 노출뿐만 아니라 차가운 부상과 삼투압은 여전히 여러 구조적 및 분자 변화를 유도하고 포유류 난모세포의 발달 잠재력을 감소. 여기에서, 우리는 청소년과 성인 기증자에게서 집합되고 냉동 보존 의 앞에 시험관에서 성숙한 양 난모세포의 병신을 위한 프로토콜을 기술합니다. 이 프로토콜에는 시험외 성숙에서 부터 진동, 온난화 및 후 침습 기간에 이르는 모든 절차가 포함되어 있습니다. MII 단계에서 진동하는 난초는 실제로 온난화 에 따라 수정 될 수 있지만 냉동 보존 절차로 인한 손상을 복원하고 발달 잠재력을 높이기 위해 수정되기 전에 추가 시간이 필요합니다. 따라서, 온난화 후 문화 조건과 타이밍은 난모세포 발달 잠재력의 회복을위한 중요한 단계입니다, 특히 난모세포는 청소년 기증자로부터 수집 될 때.
서론
여성 게임테의 장기 저장은 유전적 선정 프로그램에 의한 국내 동물 사육 개선, 전시 야생동물 종 보존 프로그램을 통한 생물다양성 보존 에 기여하고, 생체외 배아 생산 또는 핵이식 프로그램1,2,3에통합될 저장된 난모세포의 가용성에 힘입어 체외 생명공학 연구 및 응용 프로그램을 강화하는 등 광범위한 응용 프로그램을 제공할 수 있다. 청소년 난소 성 유리화는 또한 사육 프로그램4에서생성 간격을 단축하여 유전 적 이득을 증가시킬 것이다. 난모세포의 초고속 냉각 및 온난화에 의한 진동은 현재 가축 난모세포 냉동 보존5에대한 표준 접근법으로 간주됩니다. 반추제에서는, 진동하기 전에, 난소는 일반적으로 아바토이르 유래 난소2로부터얻은 여포로부터 회수 한 후 시험관 내에서 성숙된다. 성인, 특히 프레우버탈 난소4,6은실제로 냉동 보존될 난귀의 거의 무제한 수를 공급할 수 있다.
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프로토콜
동물 프로토콜 및 아래에 설명된 구현된 절차는 유럽 연합 지침 86/609/EC및 유럽 공동체 위원회 2007/526/EC의 권고에 따라 사사리 대학의 발효 윤리 지침에 따라 결정됩니다.
1. 오낭 조작을 위한 미디어 준비
- 덜벡코의 인산완충식식염을 0.1g/L 페니실린과 0.1g/L 연쇄상구균(PBS)으로 보충하여 수집된 난소의 수송을 위한 매체를 준비한다.
- 페니실린으로 보충된 밀리큐 물 1L1L로 파우더로 9.5g의 조직 배양 배지(TCM) 199를 희석하여 난피테 수집 및 성숙을 위한 배지를 준비합니다(0.1%) 연쇄상 구균(0.1%).
- 희석 후, 100mL의 매체를 필터링하고 1주일 동안 사용할 스톡 성숙 매체(SMM)로 4°C로 저장한다.
- 나머지 900mL를 25m HEPES, 0.36g/L 중탄산염, 0.1% (w/v) 폴리비닐 알코올(PVA) (pH 7.3, osmolality 290 mOsm/kg)로 보충하여 수집 매체(CM)를 준비한다.
- 0.021 g/L 중탄산염, 10% 열 처리에 필요한 에스트루스 양 세럼, 1 IU/mL FSH, IU/mL LH 1개, 시스증기인 100μL 및 피루바테 8 mg/mL로 보충된 SMM....
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결과
청소년 기증자의 난소 세포의 극온성은 성인 기증자에 비해 낮습니다. 관찰된 첫 번째 효과는 성인 난모세포에 비해 온난화 후 생존율이 낮습니다(도1A;θ 2 시험 P<0.001). 청소년 난모세포는 온난화 후 멤브레인 무결성이 낮은 것으로나타났다(그림 1B). 성숙 배지에서 트레할로오스를 사용하는 것은 이 설탕이 청소년 난모세포에서 저온 부상을 줄일 수 있는지 여부를 확인하기 위한 것이었습니다. 이 데이터는23년 동안 트레할로오스 보충을 통해 24시간 동안 숙성된 난모세포가 비처리군에 비해 진동/온난화 후 생존율이 더 높은 것으로나타났다(표 1: 85.7% vs 75.3%, θ2 시험 P<0.05). Trehalose 보충 실제로 온난화 후 높은 막 무결성과 관련 된.......
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토론
가축의 오키테 냉동 보존은 여성 유전 자원의 장기적인 보존뿐만 아니라 배아 생명 공학의 개발을 진전시킬 수 있습니다. 따라서, 난소 진동을 위한 표준 방법의 개발은 가축과 연구 분야 모두에 유리할 것이다. 이 프로토콜에서는 성인 양 난소 진동을 위한 완전한 방법이 제시되고 청소년 oocyte에 대한 효율적인 유리화 시스템의 개발을 위한 견고한 출발점을 나타낼 수 있습니다.
제안 된 방법의 주요 장점 중 하나는 난모세포 수집, 시험관 성숙, 진동 및 온난화의 모든 단계를 포함한다는 것입니다. 또한, 난모세포가 수정되기 전에 진동 절차 중에 발생한 손해로부터 회수할 수 있도록 온난화 후 문화 기간을 포함한다. 수정을 위한 최적의 시간은 저온 보존, 초기 난소세포 질, 환자 연령 및 종의 방법에 따라 조정되어야 하며, 시간 회복과 난소 세포 노화의 양상을 고려하는 데 필수적이다25,26.
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공개 사항
저자는 경쟁적인 재정적 이익이 없다고 선언합니다.
감사의 글
저자는이 작품에 대한 구체적인 자금을받지 못했습니다. 마리아 그라치아 카파이 교수와 발레리아 파시우 박사는 비디오 보이스오버와 비디오 제작 중 실험실 을 설립한 것에 대해 감사하게 인정받고 있습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 2′,7′-Dichlorofluorescin diacetate | Sigma-Aldrich | D-6883 | |
| 알부민 소 분획 V, 프로테아제 무료 | Sigma-Aldrich | A3059 | |
| Bisbenzimide H 33342 trihydrochloride (Hoechst 33342) | Sigma-Aldrich | 14533 | |
| 염화칼슘(CaCl2 2H20) | Sigma-Aldrich | C8106 | |
| 구연산 | Sigma-Aldrich | C2404 | |
| 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경 | Leica Microsystems GmbH,Wetzlar | TCS SP5 DMI 6000CS | |
| Cryotop Kitazato | Medical Biological Technologies | ||
| Cysteamine | Sigma-Aldrich | M9768 | |
| D-(-) 과당 | Sigma-Aldrich | F0127 | |
| D(+)트레할로스 탈수 | 시그마-알드리치 | T0167 | |
| 디메틸설폭사이드(DMSO) | 시그마-알드리치 | D2438 | |
| 둘베코 인산염 완충 식염수 | 시그마-알드리치 | D8537 | |
| 달걀 노른자 | 시그마-알드리치 | P3556 | |
| 에틸렌 글리콜(EG) | 시그마-알드리치 | 324558 | |
| FSH | 시그마-알드리치 | F4021 | |
| 글루탐산 | 시그마-알드리치 | G5638 | |
| 글루타르알데히드 | 시그마-알드리치 | G5882 | |
| 글리세롤 | 시그마-알드리치 | G5516 | |
| 글리신 | 시그마-알드리치 | G8790 | |
| 헤파린 | 시그마-알드리치 | H4149 | |
| 헤페스 | 시그마-알드리치 | H4034 | |
| 하이포우타린 | 시그마-알드리치 | H1384 | |
| 도립현미경 | Diaphot, 니콘 | ||
| L-알라닌 | , 시그마-알드리치 | A3534 | |
| L-아르기닌 | , 시그마-알드리치 | A3784 | |
| L-아스파라긴 | , 시그마-알드리치 | A4284 | |
| L-아스파르트산, | 시그마-알드리치 | A4534 | |
| L-시스테인 | 시그마-알드리치 | C7352 | |
| L-시스틴 | , 시그마-알드리치 | C8786 | |
| L-글루타민 | 시그마-알드리치 | G3126 | |
| LH | 시그마-알드리치 | L6420 | |
| L-히스티딘 | , 시그마-알드리치 | H9511 | |
| L-이소류신 | , 시그마-알드리치 | I7383 | |
| L-류신 | 시그마-알드리치 | L1512 | |
| L-라이신 | , 시그마-알드리치 | L1137 | |
| L-메티오닌 | 시그마-알드리치 | M2893 | |
| L-오르니틴 | , 시그마-알드리치 | O6503 | |
| L-페닐알라닌 | , 시그마-알드리치 | P5030 | |
| L-프롤린 | , 시그마-알드리치 | P4655 | |
| L-세린 | 시그마-알드리치 | S5511 | |
| L-티로신 | 시그마-알드리치 | T1020 | |
| L-발린 | , 시그마-알드리치 | V6504 | |
| 염화마그네슘 헵타하이드레이트(MgSO4.7H2O)시 | 그마-알드리치 | M2393 | |
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| MitoTracker 레드 CM-H2XRos | ThermoFisher | M7512 | |
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| 폴리비닐 알코올 (87-90% 가수분해, 평균 몰 중량 30,000-70,000) | 시그마-알드리치 | P8136 | |
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| 인산칼륨 일염기성(KH2PO4) | 시그마-알드리치 | P5655 | |
| 프로피듐 요오드화물 | 시그마-알드리치 | P4170 | |
| 양 혈청 | 시그마-알드리치 | S2263 | |
| 아지드화 나트륨 | 시그마-알드리치 | S2202 | |
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| 피루브산 나트륨 | 시그마-알드리치 | P2256 | |
| 정자 등급 분석기 | 미생물 SL | S.C.A. v 3.2.0 | |
| 통계 소프트웨어 Minitab 18.1 | 2017 Minitab | ||
| 실체 현미경 | Olimpus | SZ61 | |
| 스트렙토마이신 설페이 | 트 시그마-알드리치 | S9137 | |
| 타우린 | 시그마-알드리치 | T7146 | |
| 트리스 | 시그마-알드리치 | 15,456-3 |
참고문헌
- Arav, A. Cryopreservation of oocytes and embryos. Theriogenology. 81 (1), 96-102 (2014).
- Mullen, S. F., Fahy, G. M. A chronologic review of mature oocyte vitrification research in cattle, pigs, and sheep. Theriogenology. 78 (8), 1709-1719 (2012). <....
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