Покадровая визуализация арборизации нейронов с использованием разреженной аденоассоциированной вирусной маркировки генетически целевых популяций клеток сетчатки

Summary

Здесь мы представляем метод исследования морфогенеза нейритов в постнатальных эксплантах сетчатки мышей методом покадровой конфокальной микроскопии. Описан подход к разреженной маркировке и приобретению типов клеток сетчатки и их тонких процессов с использованием рекомбинантных аденоассоциированных вирусных векторов, которые экспрессируют мембранно-целевые флуоресцентные белки cre-зависимым образом.

Abstract

Обнаружение механизмов, которые формируют дендритные беседки, требует методов визуализации, изображения и анализа дендритов во время развития. Сетчатка мыши является мощной модельной системой для исследования специфических для типа клеток механизмов морфогенеза и связности нейронов. Организация и состав подтипов сетчатки четко определены, и генетические инструменты доступны для доступа к конкретным типам во время развития. Многие типы клеток сетчатки также ограничивают свои дендриты и / или аксоны узкими слоями, что облегчает покадровую визуализацию. Эксплантные культуры сетчатки мышей хорошо подходят для визуализации живых клеток с использованием конфокальной или многофотонной микроскопии, но методы, оптимизированные для визуализации динамики дендритов с временным и структурным разрешением, отсутствуют. Здесь представлен метод разреженной маркировки и изображения развития специфических популяций сетчатки, отмеченных системой Cre-Lox. Коммерчески доступные аденоассоциированные вирусы (AAV), используемые здесь, экспрессировали мембранно-целевые флуоресцентные белки cre-зависимым образом. Внутриглазная доставка AAV у неонатальных мышей производит флуоресцентную маркировку целевых типов клеток через 4-5 дней после инъекции (dpi). Мембранные флуоресцентные сигналы обнаруживаются с помощью конфокальной визуализации и разрешают тонкие ветви структур и динамику. Высококачественные видео, охватывающие 2-4 часа, получены из плоских креплений сетчатки, перфузированных оксигенированной искусственной спинномозговой жидкостью (aCSF). Также предоставляется конвейер постобработки изображений для деконволюции и трехмерной (3D) коррекции дрейфа. Этот протокол может быть использован для захвата нескольких клеточных поведений в интактной сетчатке и для выявления новых факторов, контролирующих морфогенез нейритов. Многие стратегии развития, изученные в сетчатке, будут иметь отношение к пониманию формирования нейронных цепей в других частях центральной нервной системы.

Introduction

Дендриты нейронов сетчатки образуют сложные, но специфические паттерны, которые влияют на их функцию в нейронных цепях. В сетчатке позвоночных различные типы ганглиозных клеток сетчатки (RGC) и интернейроны амакриновых клеток имеют уникальную дендритную морфологию, которая отличается размером беседки, расположением, длиной ветвей и ^{плотностью1}. Во время постнатального развития RGC и амакриновые клетки распространяют обильные дендритные процессы в нейропил, называемый внутренним плексиформным слоем (IPL), где они получают биполярные клеточные входы, передающие сигналы фоторецепторов2. С учетом покадровой визуализации флуо....

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол охватывает 2 дня с минимальным периодом 4-5 дней для вирусной трансдукции между экспериментальными днями (рисунок 1A). Эксперименты на животных проводятся в соответствии с Руководящими принципами Канадского совета по уходу за животными для использования животных в исследованиях и уходе за лабораторными животными в соответствии с протоколами, утвержденными Комитетом по использованию и уходу за животными Лаборатории по обслуживанию животных при Больнице для больных детей (Торонто, Канада).

1. Подготовка к неонатальным инъекциям AAV и эксперименты по визуализации

1. Выберите линию ....

Results

Используя вышеуказанный протокол, было получено, деконволюционное и скорректировано для 3D-дрейфа 3D-видео с высоким разрешением разработки дендритов звездообразующих клеток. Максимальные проекции Z-плоскости были созданы для создания 2D-видео для анализа (Дополнительное видео 1, рисунок 5A). 3D-деконволюция каждой точки времени увеличивала разрешение проекций тонкой филоподии (рисунок 5B,C). Тонкие протрузии филоподии являются .......

Discussion

Это видео демонстрирует экспериментальный конвейер, который использует существующие генетические инструменты для изображения динамики дендритов развивающихся нейронов сетчатки с помощью конфокальной живой визуализации. Также продемонстрированы внутриглазные инъекции Cre-зависимых AAV, кодирующих флуоресцентные белки, нацеленные на мембрану, в неонатальных мышей. Одиночные клетки генетически целевых популяций ярко маркируются уже при 4-5 dpi. Плоские крепления сетчатки были подготовлены для стандартных камер визуализации .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Вирусный препарат Addgene #45185-AAV9
Вирусный препарат Addgene #45186-AAV9
<стронг>Инструменты для диссекции
Целлюлозная фильтровальная бумага	Ватман	1001-070
Тонкие щипцы Dumont #5	FST	11252-20	Два щипца Dumont #5 требуются для микродиссекции сетчатки
Щипцы Dumont	VWR	82027-426
Тонкие ножницы	FST	14058-09
Мембрана из смешанного эфира целлюлозы (MCE) фильтровальная бумага, гидрофильная, 0,45 &; m размер пор	Millipore	HABG01 300
Чашка Петри, 50 & 15 мм	VWR	470313-352
Полиэтиленовая одноразовая переводная пипетка	VWR	470225-034
Кисть с круглым кончиком, размер 3/0	Обычный магазин		сетчатки FST требуются две малярные кисти размера 3/0 (или меньше)
		14007-14
Пружинные ножницы Vannas - 2,5 мм Режущая кромка	FST	15000-08
Incubation system
камерная полиэтиленовая трубка, PE-160 10'Warner	Instruments	64-0755
Двухканальный контроллер нагревателя, модель TC-344C	Warner Instruments	64-2401
HC FLUOTAR L 25x/0,95 Вт Погружной объектив	VISIR Leica	15506374
Кабель контроллера нагревателя	Warner	Instruments CC-28
Большая инкубационная камера для ванны с опорой для ломтиков	Warner Instruments	RC-27L
MPII Мини-перистальтический насос	Harvard Apparatus	70-2027
PM-6D Магнитная платформа с подогревом (нагреватель инкубационной камеры)	Warner Instruments	PM-6D
Головка насоса Трубки для мини-перистальтического насоса MPII	Harvard Apparatus	55-4148
Якорь для образца (Harps)	Warner Instruments	64-0260	Якорь для образца должен быть совместим с инкубационной камерой
Sloflo In-line Solution Heater	Warner Instruments	SF-28
<сильный>Неонатальные инъекции
10 & микро; L Микролитровый шприц серии 700, съемная игла	Hamilton Company	80314
30 г иглы для подкожных инъекций (0,5 дюйма)	BD PrecisionGlide	305106
4-дюймовый тонкостенный стеклянный капилляр, без нити (внешний диаметр 1,0 мм/0,75 мм)	WPI World Precision Instruments	TW100-4
Этанол 99,8% (разбавлять до 70% двойной дистиллированной водой [ddH2O])	Sigma-Aldrich	V001229
AAV9.hEF1a.lox.TagBFP. lox.eYFP.lox.WPRE.hGH-InvBYF	Penn Vector Core	AV-9-PV2453	Addgene Plasmid #45185
AAV9.hEF1a.lox.mCherry.lox.mTFP 1.lox. WPRE.hGH-InvCheTF	Penn Vector Core	AV-9-PV2454	Addgene Plasmid #45186
ChAT-IRES-Cre вбитая трансгенная линия мышей	The Jackson Laboratory	6410
Fast Green FCF Содержание красителя ≥ 85 %	Sigma-Aldrich	F7252-25G
Съемник микропипеток Flaming/Brown, модель P-97	Sutter Instrument Co.	P-97
Зеленая паста для татуировок	Ketchum MFG Co	329A
Фосфатно-солевой буфер, pH 7,4, жидкая, стерильно-фильтрованная, подходит для клеточных культур	Sigma-Aldrich	806552
Pneumatic PicoPump	WPI World Precision Instruments	PV-820
<сильный>Оксигенированный артишиальный раствор (aCSF) Реагенты
Дигидрат хлорида кальция (CaCl2· 2H2>O)	Sigma-Aldrich	C7902
Carbogen (5% CO2, 95% O2	AirGas	X02OX95C2003102	Поставщик может варьироваться в зависимости от региона
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G7021
HEPES, Free Acid	Bio Basic	HB0264
Раствор соляной кислоты, 1 N	Sigma-Aldrich	H9892
Гексагидрат хлорида магния (MgCl2· 6H2O)	Sigma-Aldrich	M2670
pH-Test strips (6.0-7.7)	VWR	BDH35317.604
Хлорид калия (KCl)	Sigma-Aldrich	P9541
Sodium chloride (NaCl)	Bio Basic	DB0483
Одноосновной фосфат натрия (2PO4)	Sigma-Aldrich	RDD007
Software
ImageJ	Национальные институты здравоохранения (NIH)	Открытый исходный код