هنا ، نقدم طريقة للتحقيق في مورفوجينيا العصب في شبكية العين بعد الولادة بواسطة المجهر البؤري بفاصل زمني. نحن نصف نهجا لوضع العلامات المتناثرة واكتساب أنواع خلايا الشبكية وعملياتها الدقيقة باستخدام ناقلات الفيروسات المرتبطة بالغدية المؤتلفة التي تعبر عن البروتينات الفلورية المستهدفة بالغشاء بطريقة تعتمد على Cre.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
التصوير بالفاصل الزمني للتشجير العصبي باستخدام وضع العلامات على الفيروسات المرتبطة بالأدينو المتناثرة لمجموعات خلايا الشبكية المستهدفة وراثيا
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يتطلب اكتشاف الآليات التي تنميط العرش التغصني طرقا لتصور التشعبات وتصويرها وتحليلها أثناء التطوير. شبكية العين الفأر هو نظام نموذجي قوي للتحقيق في الآليات الخاصة بنوع الخلية لتكوين الخلايا العصبية والاتصال. تنظيم وتكوين الأنواع الفرعية للشبكية محددة جيدا، والأدوات الجينية متاحة للوصول إلى أنواع محددة أثناء النمو. كما أن العديد من أنواع خلايا الشبكية تقيد التشعبات و / أو المحاور العصبية الخاصة بها إلى طبقات ضيقة ، مما يسهل التصوير بفاصل زمني. تعتبر مزارع استئصال شبكية العين للفئران مناسبة تماما لتصوير الخلايا الحية باستخدام المجهر البؤري أو متعدد الفوتونات ، ولكن الطرق المحسنة لتصوير ديناميكيات التشعبات ذات الدقة الزمنية والهيكلية غير موجودة. تظهر هنا طريقة لتسمية وتصوير تطور مجموعات شبكية محددة تتميز بنظام Cre-Lox بشكل ضئيل. الفيروسات المرتبطة بالغدية المتاحة تجاريا (AAVs) المستخدمة هنا عبرت عن البروتينات الفلورية المستهدفة بالغشاء بطريقة تعتمد على Cre. ينتج عن الولادة داخل العين ل AAVs في الفئران حديثي الولادة وضع علامات الفلورسنت على أنواع الخلايا المستهدفة قبل 4-5 أيام بعد الحقن (dpi). يمكن اكتشاف إشارات الفلورسنت الغشائية عن طريق التصوير البؤري وحل هياكل الفروع الدقيقة والديناميكيات. يتم الحصول على مقاطع فيديو عالية الجودة تمتد من 2 إلى 4 ساعات من تصوير الحوامل المسطحة للشبكية التي يتم دمجها مع السائل الدماغي الشوكي الاصطناعي المؤكسج (aCSF). كما يتم توفير خط أنابيب ما بعد معالجة الصور لإزالة الالتفاف وتصحيح الانجراف ثلاثي الأبعاد (3D). يمكن استخدام هذا البروتوكول لالتقاط العديد من السلوكيات الخلوية في شبكية العين السليمة وتحديد العوامل الجديدة التي تتحكم في تكوين الخلايا العصبية. ستكون العديد من الاستراتيجيات التنموية التي تم تعلمها في شبكية العين ذات صلة بفهم تكوين الدوائر العصبية في أماكن أخرى من الجهاز العصبي المركزي.
المقدمة
تشكل تشعبات الخلايا العصبية الشبكية أنماطا معقدة، ولكنها محددة، تؤثر على وظيفتها داخل الدوائر العصبية. في شبكية العين الفقارية، تحمل أنواع متنوعة من الخلايا العقدية الشبكية (RGCs) والخلايا العصبية الداخلية لخلايا أماكرين مورفولوجيا تغصنية فريدة تختلف في حجم الشجرة وموقعها وطول فرعها وكثافتها1. أثناء تطور ما بعد الولادة، تقوم RGCs وخلايا أماكرين بتوسيع العمليات الشجيرية الوفيرة إلى عصبية تسمى الطبقة الضفيرية الداخلية (IPL)، حيث تتلقى مدخلات الخلايا ثنائية القطب التي تنقل إشارات المستقبلات الضوئية2. وكما تم التقاطه من خلال التصوير بفاصل زمني لمجموعات شبكية العين الموصوفة بالفلورسنت في يرقات الكتاكيت أو الزرد، فإن التشكل ال....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
ملاحظة: يمتد هذا البروتوكول لمدة يومين مع فترة لا تقل عن 4-5 أيام للنقل الفيروسي بين الأيام التجريبية (الشكل 1A). يتم إجراء التجارب على الحيوانات وفقا للمجلس الكندي للمبادئ التوجيهية لرعاية الحيوانات لاستخدام الحيوانات في البحوث ورعاية الحيوانات المختبرية بموجب البروتوكولات المعتمدة من قبل لجنة استخدام ورعاية الحيوانات في مستشفى الأطفال المرضى (تورونتو ، كندا).
1. الاستعدادات لحقن AAV حديثي الولادة وتجارب التصوير
- حدد خط ماوس Cre لتسمية مجموعات خلايا الشبكية ذات الاهتمام. تأكد من التعبير عن Cre recombinase في وقت حقن AAV عن طريق العبور إلى مراسل Cre المعدل وراثيا أو من خلال تلطيخ المناعة بجسم مضاد Cre.....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
باستخدام البروتوكول أعلاه ، تم الحصول على فيديو 3D عالي الدقة لتطوير تشعبات خلايا الانفجار النجمي ، وتفكيكها ، وتصحيحها للانجراف 3D. تم إنتاج إسقاطات قصوى على مستوى Z لإنشاء مقاطع فيديو ثنائية الأبعاد للتحليل (الفيديو التكميلي 1 ، الشكل 5A). زاد الالتفاف ثلاثي الأبعاد لكل نقطة زمنية من دقة إسقاطات الفيلوبوديا الدقيقة (الشكل 5B ، C). نتوءات الفيلوبوديا الدقيقة هي سمة من سمات تطوير تشعبات الشبكية36 ويجب أن .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يوضح هذا الفيديو خط أنابيب تجريبي يستخدم الأدوات الجينية الحالية لتصوير ديناميكيات التشعبات لتطوير الخلايا العصبية الشبكية مع التصوير الحي البؤري. كما أظهرت الحقن داخل العين من AAVs المعتمدة على Cre التي تشفر البروتينات الفلورية المستهدفة بالغشاء في الفئران حديثي الولادة. يتم تصنيف الخلايا المفردة من السكان المستهدفين وراثيا بشكل مشرق في وقت مبكر من 4-5 نقطة في البوصة. تم إعداد حوامل مسطحة شبكية العين لغرف التصوير القياسية لإجراء التصوير البؤري للخلايا الحية. تنتج هذه الطريقة مقاطع فيديو عالية الدقة بفاصل زمني للخلايا ال.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين أي شيء للإفصاح عنه.
شكر وتقدير
نشكر ماديسون غراي على إعطائي يد العون عندما لم يكن لدي أي يد. تم دعم هذا البحث من قبل منحة NSERC Discovery (RGPIN-2016-06128) ، وزمالة سلون في علم الأعصاب وكرسي أبحاث كندي من المستوى 2 (إلى J.L.L). تم دعم S. Ing-Esteves من قبل برنامج أبحاث علوم الرؤية ومنح NSERC للدراسات العليا - الدكتوراه.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| Addgene الفيروسية الإعدادية # 45185-AAV9 | |||
| Addgene الفيروسية الإعدادية # 45186-AAV9 | |||
| أدوات التشريح< / strong> | |||
| ورق ترشيح السليلوز | Whatman | 1001-070 | |
| Dumont # 5 ملقط ناعم | FST | 11252-20 | مطلوب ملقطان Dumont # 5 لتشريح الشبكية الدقيق |
| ملقط دومون | VWR | 82027-426 | |
| مقص ناعم | FST | 14058-09 | |
| أوراق ترشيح غشاء إستر السليلوز المختلط (MCE) ، محبة للماء ، 0.45 وميكرو ؛ م حجم المسام | Millipore | HABG01 300 | |
| طبق بتري ، 50 & مرات 15 مم | VWR | 470313-352 | |
| ماصة نقل بولي إيثيلين يمكن التخلص منها | VWR | 470225-034 | |
| فرشاة طلاء ذات طرف دائري ، مقاس 3/0 | مطلوب فرشتان | للطلاء بحجم 3/0 (أو أصغر) | |
| لمقص الشبكية الجراحي | FST | 14007-14 | |
| مقص زنبركي Vannas - 2.5 مم حافة | القطع FST | 15000-08 | |
| < قوي > نظام حضانة التصوير المباشر < / | |||
| الغرفة ، PE-160 10'Warner | Instruments | 64-0755 | |
| وحدة تحكم سخان ثنائية القناة ، موديل TC-344C | Warner Instruments | 64-2401 | |
| HC FLUOTAR L 25x / 0.95 W VISIR غمس الهدف | Leica | 15506374 | |
| كابل وحدة التحكم في السخان | Warner Instruments | CC-28 | |
| غرفة حضانة حمام كبيرة مع دعم شريحة | Warner Instruments | RC-27L | |
| MPII مضخة تمغجية صغيرة | Harvard Apparatus | 70-2027 | |
| PM-6D منصة تسخين مغناطيسية (سخان غرفة الحضانة) | Warner Instruments | PM-6D | |
| قطع أنابيب رأس المضخة لمضخة التمعج المصغرة MPII | جهاز هارفارد | 55-4148 | |
| مرساة عينة (قيثارة) | مرساة العينة Warner Instruments | 64-0260 | متوافقة مع غرفة الحضانة |
| Sloflo In-Line Solution Heater | Warner Instruments | SF-28 | |
| Neonatal Injections< / strong> | |||
| 10 & L حقنة ميكرولتر سلسلة 700 ، إبرة قابلة للإزالة | شركة هاميلتون | 80314 | |
| 30 جرام إبر تحت الجلد (0.5 بوصة) | BD PrecisionGlide | 305106 | |
| بوصة رقيقة زجاجية شعرية ، بدون خيوط (1.0 مم القطر الخارجي / 0.75 مم) & nbsp ؛ | WPI World Precision Instruments | TW100-4 | |
| Ethanol 99.8٪ (للتخفيف إلى 70٪ بالماء المقطر المزدوج [ddH2< / sub>O]) | Sigma-Aldrich | V001229 | |
| AAV9.hEF1a.lox.TagBFP. lox.eYFP.lox.WPRE.hGH-InvBYF | Penn Vector Core | AV-9-PV2453 | Addgene Plasmid #45185 |
| AAV9.hEF1a.lox.mCherry.lox.mTFP 1.lox. WPRE.hGH-InvCheTF | Penn Vector Core | AV-9-PV2454 | Addgene Plasmid # 45186 |
| ChAT-IRES-Cre خط الماوس المعدل وراثيا | The Jackson Laboratory | 6410 | |
| Fast Green FCF Dye محتوى & ge ؛ 85٪ | Sigma-Aldrich | F7252-25G | |
| مجتذب ماصة دقيقة ملتهبة / براون ، موديل P-97 | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| معجون وشم أخضر | Ketchum MFG Co | 329A | |
| محلول ملحي مخزن بالفوسفات ، درجة الحموضة 7.4 ، سائل ، مفلتر معقم ، مناسب لزراعة الخلايا | Sigma-Aldrich | 806552 | |
| Pneumatic PicoPump | WPI World Precision Instruments | PV-820< | |
| قوي > كواشف السائل الدماغي النخاعي المؤكسج (aCSF) < / قوي> | |||
| ثنائي هيدرات كلوريد الكالسيوم (CaCl2< / sub>& middot; 2H2< / sub>O) | Sigma-Aldrich | C7902 | |
| كربوجين (5٪ CO2< / sub> ، 95٪ O2< / sub>) | X02OX95C2003102 | AirGas | اعتمادا على المنطقة |
| D- (+) -Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| Bio Basic | HB0264 | ||
| ، 1 N | سيجما ألدريتش | H9892 | |
| سداسي هيدرات كلوريد المغنيسيوم (MgCl2< / sub>· 6H 2 < / sub >O) شرائط | اختبار الأس الهيدروجيني Sigma-Aldrich | M2670 | |
| (6.0-7.7) | VWR | BDH35317.604 | |
| كلوريد البوتاسيوم (KCl) | سيجما ألدريتش | P9541 | |
| كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم) Bio | Basic | DB0483 | |
| فوسفات الصوديوم أحادي القاعدة (NaH 2< / sub>PO 4< / sub>) | سيجما ألدريتش | RDD007 | |
| Software | |||
| ImageJ | المعاهد الوطنية للصحة (NIH) | مصدر |
المراجع
- Lefebvre, J. L., Sanes, J. R., Kay, J. N. Development of dendritic form and function. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 31, 741-777 (2015).
- Graham, H. K., Duan, X. Molecular mechanisms regulating synapt....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
استكشف المزيد من المقالات
