대장균은 신생아 그람 음성 세균성 뇌막염의 주요 원인입니다. 세균성 감염 도중, 호중구에 의해 생성된 반응성 산소 종은 중요한 bactericidal 역할을 합니다. 여기서 우리는 뇌막염 대장균에 대응하여 호중구에서 반응성 산소 종을 검출하는 방법을 소개한다.
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방법 논문
수막 대장균에 감염된 호중구의 반응성 산소 종의 실시간 정량화
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
대장균 (대장균)은신생아 뇌막염을 유발하는 가장 흔한 그램 음성 박테리아입니다. 혈액-뇌 장벽을 통한 세균혈및 세균성 침투의 발생은 대장균 뇌막염의 발달을 위한 필수 단계입니다. 반응성 산소 종 (ROS)은 침략 된 병원체를 파괴하는 호중구의 주요 bactericidal 메커니즘을 나타냅니다. 이 프로토콜에서, 수막 대장균에 감염된 호중구에서의 시간 의존적인 세포내 ROS 생산은 실시간 형광 마이크로 플레이트 판독기에 의해 검출된 형광 ROS 프로브를 사용하여 정량화되었다. 이 방법은 또한 병원체 호스트 상호 작용 도중 포유류 세포에 있는 ROS 생산의 평가에 적용될 수 있습니다.
서론
신생아 세균성 뇌막염은 일반적인 소아 전염병입니다. K1 캡슐을 가진대장균(E. coli)은신생아 세균성 뇌막염을 유발하는 가장 흔한 그램 음성 병원균으로, 전체 발병률 1,2,3의약 80%를 차지한다. 항균 화학 요법과 지원 치료의 진보에도 불구하고 세균 성 뇌막염은 여전히 높은 이환율과 사망률4를가진 가장 파괴적인 조건 중 하나입니다.
신생아 세균성 뇌막염의 발생은 일반적으로 신생아의 국소 병변으로부터 말초 순환으로 병원성 박테리아의 진입에 의한 박테혈으로 시작하여 혈액-뇌 장벽(BBB)을 통해 뇌로 침투하여 수막4의염증을 초래한다. 박테리아의 발병은 호중구와 대식세포 등을 포함한 박테리아와 숙주 면역 세포 사이의 상호 작용에 달려 있습니다. 백혈구의 ~50-70%를 차지하는 호중구는 세균 감염5,6에대한 첫 번째 방어선이다. 박테리아의 침입 동안, 활....
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프로토콜
이 연구에 적용 된 자원 봉사자의 말초 혈액은 중국 의과 대학 (#2020-2020-237-2)의 첫 번째 병원의 기관 검토 위원회에 의해 승인되었습니다.
1. 시약 및 문화 매체의 준비
- NH4Cl8.29g, KHCO31g, Na2EDTA 37.2 mg을 이중 증류수 1L에 첨가하여 적혈구 용해 완충제를 준비하고 pH를 7.2-7.4로 조절한다. 0.22 μm 필터를 사용하여 여과에 의해 박테리아를 제거합니다.
- RPMI 1640 배지에 5% 태아 소 혈청을 첨가하여 호중구에 대한 실험 배양 배지를 준비하고 4°C에 저장한다. 사용하기 전에 실온에 평형.
참고: 페놀 레드 없이 RPMI 1640 배지를 사용합니다. - NaCl 8g, KCl 0.2g, Na2HPO 4 ·2H2O 및 0.2 g의 KH2PO4를1L 유리 플라스크에서 이중 증류수 1L에 추가하여 인산염 완충식 식염수(PBS)를 준비한다. pH를 7.2-7.4로 조정합니다. 121 °C에서 15 분 동안 오토 클레이브하십시오.
- 디메틸 설플옥사이드(DMSO)....
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결과
이 문서에 설명된 프로토콜을 사용하여, 호중구는 인간 말초 혈액에서 격리되고 E44 감염에 응하여 ROS 수준의 변경을 검출하기 위하여 형광 프로브 DHE로 로드되었습니다. 여기서, 우리는 실시간으로 마이크로 플레이트 판독기에 의해 결정된 E44 균주에 의해 생성된 ROS 생산을 보여주는 대표적인 데이터를 제공합니다. 100의 MOI에서 E44 균주를 첨가함으로써 ROS 수치가 즉시 증가하고 시간 의존적 방식으로 연속 상승 추세를보였다(도 1). 호중구에서 세포내 ROS의 잘 알려진 ROS 유도기인 PMA를 추가하여 초기 단계에서 평평한 곡선을 제시하는 S자형 곡선을 관찰한 후 20분에서 40분으로 크게 증가하여 60분(그림1)으로정점을 찍었습니다.
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토론
호중구는 인간의 혈액 순환에서 백혈구의 가장 풍부한 구성 요소역할을합니다. 그(것)들은 병원체 의 침략에 대하여 방어의 첫번째 선을 구축하는 타고난 인간 면역 계통에 있는 중요한 이펙터 세포입니다(11). ROS의 생성은 phagocytosis11다음호중구의 주요 bactericidal 기계장치 중 하나를 나타낸다. 최근 연구에 따르면 호중구 세포 외 트랩(NET)이라고 불리는 호중구에 의해 방출된 순과 같은 구조도6,11,12의박테리아 살해 과정에 관여하는 것으로 나타났다.
병원성 미생물의 자극에 의해 유도된 호중구에 의해 생성된 ROS는 주로 2개의 막 결합 서브유닛(gp91 phox 및 p22phox)과3.......
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공개 사항
저자는 경쟁적인 재정적 이익이나 기타 이해 상충을 선언하지 않습니다.
감사의 글
이 작품은 중국 국립 자연과학 재단(31670845, 31870832, 320008111)과 랴오닝성 우수교수(LJH2018-35)의 지원을 받았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 15mL 폴리프로필렌 원추형 원심분리기 튜브 | KIRGEN | KG2611 | |
| 96웰 플레이트 | Corning | 3025 | |
| Agar DINGGUO | DH010-1.1 | ||
| Autuomated cell counter | Bio-rad | 508BR03397 | |
| 생물학적 안전성 Carbinet | Shanghai Lishen | Hfsafe-1200Lcb2 | |
| 뇌 심장 주입 | BD | 237500 | |
| CD16 Microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-045-701 | |
| 원심분리기 | Changsha Xiangyi | TDZ5-WS | |
| Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Dihydroethidium (DHE) | MedChemExpress | 104821-25-2 | |
| 소 태아 혈청 | Cellmax | SA211.02 | |
| 인큐베이터 | Heraeus | Hera Cell | |
| MACS 분리 완충액 | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| Microplate Reader | 분자 장치 | SpectraMax M5 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Beyoitme | S1819-1mg | |
| QuadroMACS 분리 장치 | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| Rifampicin | Solarbio | 13292-46-1 | |
| RPMI1640 매체 | Sangon Biotech | E600027-0500 | |
| 온도 조절 셰이커 | Shanghai Zhicheng | ZWY-100D | |
| 트립톤 | OXOID | LP0042 | |
| 효모 추출물 | OXOID | LP0021 |
참고문헌
- Kim, K. S. Acute bacterial meningitis in infants and children. Lancet Infectious Diseases. 10 (1), 11(2010).
- Woll, C., et al. Epidemiology and Etiology of Invasive Bacterial Infection in Infants
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