פיתחנו גישה חדשנית של אובדן תפקוד הכוללת החדרה ואינטגרציה גנומית של רצפי מיקרו-רנ"א מלאכותיים לעוברי אפרוחים באמצעות אלקטרופורציה ומערכת טרנספוזון Tol2. טכניקה זו מספקת מתודולוגיית פירוק גנים חזקה ויציבה לחקר תפקוד גנים במהלך ההתפתחות.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
גישת אובדן תפקוד ברשתית הגוזל העוברי באמצעות ביטוי טרנסגני בתיווך Tol2 של מיקרו-רנ"א מלאכותי
במאמר זה
סיכום
תקציר
רשתית האפרוחים היא כבר מזמן מערכת מודל חשובה בנוירוביולוגיה התפתחותית, עם יתרונות הכוללים את גודלה הגדול, התפתחותה המהירה ונגישותה להדמיה ולמניפולציות ניסיוניות. עם זאת, המגבלה הטכנית העיקרית שלה הייתה היעדר גישות חזקות לאובדן תפקוד עבור ניתוח תפקודי גנים. פרוטוקול זה מתאר מתודולוגיה של השתקת גנים ברשתית האפרוחים המתפתחת הכוללת ביטוי מהונדס של מיקרו-רנ"א מלאכותי (miRNAs) באמצעות מערכת טרנספוזון Tol2. בגישה זו, פלסמיד טרנספוזון Tol2 המכיל קלטת ביטוי לסמן EmGFP (חלבון פלואורסצנטי ירוק אמרלד) ורצפי קדם-miRNA מלאכותיים כנגד גן מטרה מוכנס לרשתית האפרוח העוברי עם מבנה ביטוי טרנספוזאז Tol2 על ידי באלקטרופורציה של אובו . בתאי הרשתית הנגועים, הטרנספוזואז מזרז את כריתת קלטת הביטוי מווקטור הטרנספוזון ושילובה בכרומוזומי המאכסן, מה שמוביל לביטוי יציב של miRNA וחלבון EmGFP. במחקר הקודם שלנו, הראינו כי הביטוי של Nel, גליקופרוטאין המפעיל פונקציות מרובות בהתפתחות עצבית, יכול להיות מדוכא באופן משמעותי ברשתית אפרוח מתפתחת באמצעות טכניקה זו. התוצאות שלנו מצביעות על כך שמתודולוגיה זו גורמת לדיכוי יציב וחזק של ביטוי גנים ובכך מספקת גישה יעילה של אובדן תפקוד למחקרים על התפתחות הרשתית.
מבוא
רשתית בעלי החוליות היא מערכת מודל חשובה לחקר התפתחות עצבית. למרות מיקומה ההיקפי, הרשתית היא שלוחה אנטומית והתפתחותית של מערכת העצבים המרכזית, ועצב הראייה, המורכב מאקסונים של תאי גנגליון ברשתית, מייצג מערכת בתוך מערכת העצבים המרכזית. לרשתית האפרוחים יתרונות משמעותיים כמערכת מודל לחקר המנגנון המולקולרי של ההתפתחות העצבית: היא גדולה ומתפתחת במהירות; יש לו דמיון מבני ופונקציונלי לרשתית האנושית; הוא נגיש מאוד עבור ויזואליזציה ומניפולציות ניסיוניות. מנגנונים מולקולריים של התרבות תאים והתמיינותם, מורפוגנזה והנחיית אקסונים במהלך ההתפתחות העצבית נחקרו בהרחבה באמצעות רשתית העוף.
בשני העשורים האחרונים נעשה שימוש מוצלח באלקטרופורציה כדי להחדיר גנים חוץ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. בניית וקטורי ביטוי miRNA
הערה: ההליכים לבניית וקטורי ביטוי miRNA (שלבים 1.1-1.3, 1.5-1.6.) ממוטבים עבור ערכת ביטוי miRNA, ערכת ביטוי miR של Block-iT Pol II miR עם EmGFP, כפי שתואר קודם לכן15,16. הערכה מספקת את וקטור הביטוי שנועד לאפשר ביטוי miRNA (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA), וקטור בקרה (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-negative control plasmid), ריאגנטים נלווים והוראות לייצור וקטורי ביטוי miRNA (ראה טבלת חומרים)17.
- תכנון אוליגוס DNA חד-גדילי המקודד קדם-miRNA כנגד גן המטרה: תכנון אוליגוס DNA חד-גדילי (אוליגוס "גדיל עליון" (א....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
בניית מבני טרנספוזון Tol2 לביטוי miRNA מלאכותי כנגד Nel
Nel (Neural Epidermal growth factor (EGF)-Like; ידוע גם בשם Nell2) הוא גליקופרוטאין חוץ-תאי. יש לו דמיון מבני עם thrombospondin-1 והוא בא לידי ביטוי בעיקר במערכת העצבים20,21. הוכחנו בעבר כי Nel מווסת התמיינות והישרדות של תאי גנגליון רשתית15 ופועל כרמז מנחה מעכב עבור אקסונים ברשתית22,23,24
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
פרוטוקול זה מספק מדריך מפורט להשתקת גנים ברשתית האפרוחים המתפתחת על ידי ביטוי מהונדס של miRNA מלאכותי באמצעות אלקטרופורציה ומערכת טרנספוזון Tol2.
הגורמים הבאים הם בעלי חשיבות קריטית בביצוע טכניקה זו בהצלחה. ראשית, קריטי להשתמש ברצפי miRNA שאושרו כבעלי השפעות חזקות של הפלה. לפני החלתם עבור אלקטרופורציה באובו , בדוק רצפי קדם-miRNA בודדים עבור יעילות דיכוי גנים במבחני מבחנה (שלב 1.4) ושרשר שני רצפי קדם-miRNA המראים את פעילויות ההפלה הגבוהות ביותר (שלב 1.5). שנית, חשוב ל.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף.
תודות
הווקטורים pT2K-CAGGS ו-pCAGGS-T2TP סופקו באדיבות על ידי יושיקו טקהאשי (אוניברסיטת קיוטו, קיוטו, יפן) וקואיצ'י קוואקאמי (המכון הלאומי לגנטיקה, מישימה, יפן), בהתאמה. אנו מודים למיכאל ברברוגלו על קריאתו המכרעת של כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהחברה המלכותית ומועצת המחקר לביוטכנולוגיה ומדעי הביולוגיה (BBSRC) (בריטניה) ל- M.N.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| מחט 18 G, ערכת 2 אינץ' | VWR | 89219-320 | |
| ערכת AP-TAG ערכת A ו-AP-TAG B | GenHunter Corp | Q201 ו-Q202 | וקטורי פלסמיד לייצור חלבוני היתוך AP (https://www.genhunter.com/products/ap-tag-kit-a.html, https://www.genhunter.com/products/ap-tag-kit-b.html) |
| Block-iT RNAi Designer | Invitrogen | כלי מקוון לבחירת רצפי יעד ותכנון רצפי קדם-miRNA (https://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/) | |
| BSA 10 מ"ג | כבלי סיגמא-אולדריץ' | A2153 | |
| C115CB כבלי | Sonidel | C115CB | |
| Sonidel | C117 | ||
| https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼252 צינורות נימיים עם סיבי אומגה נקודות (מחטי מיקרופיפטה) | FHC | 30-30-1 | 1 מ"מ OD 0.75 מ"מ תעודת זהות |
| CUY21 אלקטרופורטור גל מרובע | Nepa Gene | CUY21 | |
| דיאתנולמין (pH 9.8) | Sigma-Aldrich | D8885 | |
| ניתוח מיקרוסקופ | |||
| ביצית חממה | Kurl | B-Lab-600-110 | |
| מחזיק אלקטרודות | https://www.flemingoutdoors.com/kuhl%2D%2D-600-egglaboratory-incubator%2D%2D-b-lab-600-110.html Sonidel | CUY580 | https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼85 |
| אלקטרודות | Nepa Gene | CUY611P3-1 | https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼94 |
| Electromax DH10B | Invitrogen | 18290-015 | תאי E. coli Electrocompetence |
| FCF | Sigma-Aldrich | F7258 | |
| ביצי עוף מופרות (Gallus gallus) | מתקבל מספקים מסחריים (למשל נהר צ'ארלס) או מחקלאים | ||
| מקור | |||
| FuGene 6 מגיב טרנספקציה | Promega | E2691 | |
| מזרק המילטון (50 μ L) | Sigma-Aldrich | 20715 | Hamilton Cat No 80901 |
| תמיסת מלח מאוזנת של הנקס | Sigma-Aldrich | H6648 | |
| שמן מינרלי כבד | Sigma-Aldrich | 330760 | |
| HEPES | GIBCO | 15630080 | |
| L-הומארגינין | Sigma-Aldrich | H10007 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 13112 | |
| מיקרומניפולטור | Narishige (יפן) | MM3 | http://products.narishige-group.com/group1/MM-3/electro/english.html |
| חולץ מיקרופיפטה | מכשיר תריס | P97 | |
| p-ניטרופנילפוספט | סיגמא-אולדריץ' | 20-106 | |
| PBS | סיגמא-אולדריץ' | D8662 | |
| pCAGGS-T2TP וקטור | פלסמיד ביטוי טרנספוזאז Tol2. מתנה נדיבה של קואיצ'י קוואקמי (המכון הלאומי לגנטיקה, יפן). זמין גם מ-Addgene. | ||
| Pfu | ThermoFisher | F566S | |
| Picospritzer (אופציונלי) | מערכת מיקרו-הזרקת לחץ | פרקר | |
| ערכת מקסי פלסמיד | Qiagen | 12163 | ערכת מקסיפרפ פלסמיד |
| pT2K-CAGGS וקטור | טרנספוזון Tol2. מסופק בחביבות על ידי יושיקו טקהאשי (אוניברסיטת קיוטו, יפן) | ||
| צינורות PVC | VWR (בריטניה) | 228-3830 | |
| Spectinomycin | Sigma-Aldrich | S9007-5 | |
| T4 DNA ligase | Promega | M1801 | |
| ערכת ביטוי ה- RNA BLOCK-iT Pol II miR עם K493600 | EmGFP Invitrogenמכיל את וקטור ביטוי ה-miRNA (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA), וקטור בקרה (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-פלסמיד בקרה שלילי), ריאגנטים אביזרים והוראות (https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/K493600?SID.srch-hj-K4936-00) | ||
| ציקלר |
מקורות
- Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo. Biochemical and Biophysical Research Communications. 230, 376-380 (1997).
- Funahashi, J., et al.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
