我们开发了一种新的功能缺失研究方法，该方法通过利用人工微小RNA序列的导入及其在鸡胚基因组中的整合来实现 在卵内 电穿孔与Tol2转座子系统。该技术为研究发育过程中基因功能提供了高效且稳定的基因敲低方法。
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摘要
摘要
鸡视网膜长期以来一直是发育神经生物学研究中的重要模型系统，其优势包括组织体积大、发育迅速，以及便于进行可视化观察和实验操作。然而，该系统主要的技术局限在于缺乏高效的基因功能缺失研究手段。本实验方案描述了一种利用Tol2转座子系统通过转基因表达人工微小RNA（miRNA）实现鸡胚胎视网膜中基因沉默的方法。该方法将包含EmGFP（emerald green fluorescent protein）标记基因和针对目标基因的人工pre-miRNA序列的表达盒的Tol2转座子质粒，与Tol2转座酶表达载体共同导入鸡胚视网膜中 在卵内 电穿孔。在转染的视网膜细胞中，转座酶催化表达盒从转座子载体上切除，并将其整合到宿主染色体中，从而实现miRNA和EmGFP蛋白的稳定表达。在我们之前的研究中，已证明利用该技术可显著抑制Nel（一种在神经发育中具有多种功能的糖蛋白）在发育中鸡胚视网膜中的表达。结果表明，该方法可诱导基因表达的稳定且高效的抑制，因此为视网膜发育研究提供了一种有效的功能缺失研究策略。
引言
脊椎动物的视网膜是研究神经发育的重要模型系统。尽管位于外周，视网膜在解剖学和发育上属于中枢神经系统的延伸，而由视网膜神经节细胞轴突组成的视神经，代表了中枢神经系统内的一条神经束。鸡视网膜作为研究神经发育分子机制的模型系统具有显著优势：其组织较大且发育迅速，结构和功能与人类视网膜具有相似性，并且便于进行可视化观察和实验操作。利用鸡视网膜，研究人员已广泛深入地探讨了神经发育过程中细胞增殖与分化、形态发生以及轴突导向的分子机制。
在卵内 电穿孔技术在过去二十年中已成功用于将外源基因导入发育中的鸡胚细胞。该技术可用于标记发育中的细胞、细胞命运示踪、细胞迁移及轴突投射路径追踪，以及外源基因表达研究 体内 基因功能分析。条件 在卵内 电穿孔法在鸡胚中实现高效异位基因表达已得到充分建立1,2,3.
尽管具有上述优势，缺乏一种稳定的基因功能缺失研究技术一直是鸡胚研究中的主要技术局限。将小干扰RNA（siRNAs）电穿孔导入鸡胚后4 或短发夹RNA（shRNA）的表达载体5 显示靶基因的敲低，但这些方法中的....
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方案
1. miRNA 表达载体的构建
注意：构建miRNA表达载体的步骤（步骤1.1–1.3、1.5–1.6）已针对miRNA表达试剂盒进行优化，即Block-iT Pol II miR RNA表达试剂盒（含EmGFP），如先前所述15,16。该试剂盒提供用于miRNA表达的表达载体（pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA）、对照载体（pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-阴性对照质粒）、辅助试剂以及制备miRNA表达载体的操作说明（参见材料表）17。
- 设计编码靶基因pre-miRNA的单链DNA寡核苷酸：设计单链DNA寡核苷酸（"上链" 寡核苷酸（靶向pre-miRNA）以及 "底链" 寡核苷酸（正义链寡核苷酸的互补链）使用在线工具 RNAi Designer（见 材料表）。参见 图2 单链寡核苷酸所需具备的特征（图2A）以及靶序列的示例（图2B).
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结果
构建用于表达靶向Nel的人工miRNA的Tol2转座子载体
Nel (N神经的 E表皮生长因子（EGF）-Like（也称为Nell2）是一种细胞外糖蛋白，其结构与血小板反应蛋白-1具有相似性，主要在神经系统中表达。20,21我们先前已证明，Nel 调控视网膜神经节细胞的分化与存活15 并作为视网膜轴突的抑制性导向信号22,23,24在发育中的鸡视网膜中，Nel 的表达于 HH15 期（胚胎第 (E) 2.5 天）在预定色素上皮区域被检测到。至 HH20 期（E3.5），Nel 的表达也在新分化的视网膜神经节细胞中出现。Nel 在色素上皮和视网膜神经节细胞中的强表达至少持续至 E18
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讨论
本方案通过在鸡胚视网膜发育过程中利用in ovo电穿孔及Tol2转座子系统进行人工miRNA的转基因表达，提供了基因沉默的详细操作指南。
以下因素对于成功实施该技术至关重要。首先，必须使用经证实可产生显著敲低效果的miRNA序列。在将其应用于 在卵内 电穿孔，测试单个pre-miRNA序列在基因沉默效率中的作用 体外 检测（步骤1.4）以及两条显示最高敲低活性的pre-miRNA序列（步骤1.5）。其次，在插入显微注射针以注入DNA溶液时，必须注意不要损伤视泡及其周围神经组织。对胚胎造成过度损伤可能导致胚胎畸形或死亡。为避免组织损伤，应以正确方向将显微注射针插入视泡。较细且更尖锐的针尖有助于更顺畅地穿透视泡，从而减少组织损伤。然而，针尖过细的注射针在加载和释放DNA溶液时可能存在困难。在本研究中，采用针尖开口直径为10–20 µm的注射针。第三，确保DNA溶液完全充满整个视泡（可通过快绿染料的扩散范围进行观察）。第四，将电极置于最佳位置，以使DNA靶向至视泡的特定区域（例如，颞侧或鼻侧）。带负电荷的DNA分子将向阳极方向移动，因.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
pT2K-CAGGS 和 pCAGGS-T2TP 载体分别由 Yoshiko Takahashi（日本京都大学，京都，日本）和 Koichi Kawakami（日本遗传学国立研究所，三岛，日本）惠赠。我们感谢 Michael Berberoglu 对稿件的重要审阅。本工作获得了英国皇家学会和生物技术和生物科学研究理事会（BBSRC）向 M.N. 提供的资助支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 18 G 针头，2" | VWR | 89219-320 | |
| AP-TAG 试剂盒 A 和 AP-TAG 试剂盒 B | GenHunter Corp | Q201 和 Q202 | 用于构建 AP 融合蛋白的质粒载体（https://www.genhunter.com/products/ap-tag-kit-a.html, https://www.genhunter.com/products/ap-tag-kit-b.html） |
| Block-iT RNAi 设计工具 | Invitrogen | 一种在线工具，用于选择靶序列并设计 pre-miRNA 序列（https://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/） | |
| BSA 10 mg | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| C115CB 电缆 | Sonidel | C115CB | https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼254 |
| C117 电缆 | Sonidel | C117 | https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼252 |
| 带 omega 点纤维的毛细管（微移液针） | FHC | 30-30-1 | 外径 1 mm，内径 0.75 mm |
| CUY21 方波电穿孔仪 | Nepa Gene | CUY21 | |
| 二乙醇胺（pH 9.8） | Sigma-Aldrich | D8885 | |
| 解剖显微镜 | |||
| 孵蛋器 | Kurl | B-Lab-600-110 | https://www.flemingoutdoors.com/kuhl%2D%2D-600-egglaboratory-incubator%2D%2D-b-lab-600-110.html |
| 电极夹持器 | Sonidel | CUY580 | https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼85 |
| 电极 | Nepa Gene | CUY611P3-1 | https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼94 |
| Electromax DH10B | Invitrogen | 18290-015 | 电转化感受态大肠杆菌细胞 |
| 亮蓝 FCF | Sigma-Aldrich | F7258 | |
| 受精鸡卵（Gallus gallus） | 从商业供应商（例如 Charles River）或本地农户处获得 | ||
| 鹅颈式光纤光源 | |||
| FuGene 6 转染试剂 | Promega | E2691 | |
| Hamilton 微量注射器（50 μL） | Sigma-Aldrich | 20715 | Hamilton 货号 80901 |
| Hanks' 平衡盐溶液 | Sigma-Aldrich | H6648 | |
| 重矿物油 | Sigma-Aldrich | 330760 | |
| HEPES | GIBCO | 15630080 | |
| L-高精氨酸 | Sigma-Aldrich | H10007 | |
| MgCl₂ | Sigma-Aldrich | 13112 | |
| 显微操作仪 | Narishige（日本） | MM3 | http://products.narishige-group.com/group1/MM-3/electro/english.html |
| 微移液管拉制仪 | Shutter Instrument | P97 | |
| 对硝基苯磷酸盐 | Sigma-Aldrich | 20-106 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8662 | |
| pCAGGS-T2TP 载体 | Tol2 转座酶表达质粒。由日本遗传学研究所河上晃一慷慨惠赠。也可从 Addgene 获取。 | ||
| Pfu | ThermoFisher | F566S | |
| Picospritzer（可选） | Parker | 压力微注射系统 | |
| 质粒大提试剂盒 | Qiagen | 12163 | 质粒大提纯试剂盒 |
| pT2K-CAGGS 载体 | Tol2 转座子载体。由日本京都大学高桥佳子惠赠 | ||
| PVC 管路 | VWR（英国） | 228-3830 | |
| 壮观霉素 | Sigma-Aldrich | S9007-5 | |
| T4 DNA 连接酶 | Promega | M1801 | |
| BLOCK-iT Pol II miR RNA 表达试剂盒（含 EmGFP） | Invitrogen | K493600 | 包含 miRNA 表达载体（pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA）、对照载体（pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-阴性对照质粒）、辅助试剂及说明书（https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/K493600?SID.srch-hj-K4936-00） |
| PCR 仪 |
参考文献
- Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo. Biochemical and Biophysical Research Communications. 230, 376-380 (1997).
- Funahashi, J., et al.
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