我々は、ニワトリ胚への人工マイクロRNA配列の導入とゲノム組み込みを、 in ovo エレクトロポレーションとTol2トランスポゾンシステムを用いて行う新しい機能喪失アプローチを開発しました。この技術は、発生中の遺伝子機能の研究のための堅牢で安定した遺伝子ノックダウン方法論を提供します。
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方法論記事
Tol2トランスポゾンを介した人工マイクロRNAのトランスジェニック発現を用いたニワトリ胚網膜における機能喪失アプローチ
この記事について
サマリー
要約
ニワトリ網膜は、その大きなサイズ、迅速な発達、視覚化や実験操作のためのアクセシビリティなどの利点を備えた、発生神経生物学における重要なモデルシステムです。しかし、その主な技術的限界は、遺伝子機能解析のための堅牢な機能喪失アプローチの欠如でした。このプロトコルは、Tol2トランスポゾンシステムを使用した人工マイクロRNA(miRNA)のトランスジェニック発現を含む、発生中のニワトリ網膜における遺伝子サイレンシングの方法論を説明しています。このアプローチでは、EmGFP(エメラルドグリーン蛍光タンパク質)マーカーの発現カセットと標的遺伝子に対する人工pre-miRNA配列を含むTol2トランスポゾンプラスミドを、 in ovo エレクトロポレーションによってTol2トランスポザーゼ発現コンストラクトとともに胚性ニワトリ網膜に導入します。トランスフェクトされた網膜細胞において、トランスポザーゼはトランスポゾンベクターからの発現カセットの切除および宿主染色体への組み込みを触媒し、miRNAおよびEmGFPタンパク質の安定した発現をもたらす。これまでの研究では、この手法を用いることで、神経発生において複数の機能を発揮する糖タンパク質であるNelの発現を、発生中のニワトリ網膜において有意に抑制できることを実証しました。我々の結果は、この方法論が遺伝子発現の安定的かつ堅牢な抑制を誘導し、したがって網膜発生の研究のための効率的な機能喪失アプローチを提供することを示しています。
概要
脊椎動物の網膜は、神経発生を研究するための重要なモデルシステムです。その末梢位置にもかかわらず、網膜は解剖学的および発達的に中枢神経系の延長であり、網膜神経節細胞の軸索からなる視神経は中枢神経系内の管を表す。ひよこ網膜は、神経発達の分子メカニズムを研究するためのモデルシステムとして重要な利点があります:それは大きく、急速に発達します。それは人間の網膜と構造的および機能的類似性を持っています。視覚化や実験的な操作に非常にアクセスしやすいです。神経発生中の細胞増殖・分化、形態形成、軸索誘導の分子機構は、ニワトリ網膜を用いて広く研究されている。
卵子では、エレクトロポレーションは、発生中のニワトリ胚の細胞に異所性遺伝子を導入するために過去20年間にわたって首尾よく使用されてきました。この技術により、発生中の細胞の標識、細胞運命の追跡、細胞移動および軸索路のトレース、および遺伝子機能のin vivo分析のための異所性遺伝子発現が可能になります。ニワトリ胚における効率的な異所性遺伝子発現のためのin ovoエレクトロポレーションの条件は十分に確立されている1,2,3。
これらの利点にもかかわら....
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プロトコル
1. miRNA発現ベクターの構築
注:miRNA発現ベクターを構築するための手順(ステップ1.1-1.3、1.5-1.6)は、前述のように、miRNA発現キットであるEmGFPを用いたBlock-iT Pol II miR RNA発現キット用に最適化されています15,16。このキットには、miRNA発現を可能にするように設計された発現ベクター(pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA)、コントロールベクター(pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA陰性コントロールプラスミド)、アクセサリー試薬、およびmiRNA発現ベクターを作製するための説明書(材料表参照)が含まれています17。
- 標的遺伝子に対するpre-miRNAをコードする一本鎖DNAオリゴの設計:オンラインツールRNAi Designer(材料表参照)を使用して、一本鎖DNAオリゴ(「トップストランド」オリゴ(ターゲットプレmiRNA)および「ボトムストランド」オリゴ(トップストランドオリゴの相補体))を設計します。一本鎖オリゴの必要な特徴(図2A)とターゲット配....
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結果
Nelに対する人工miRNA発現のためのTol2トランスポゾンコンストラクトの構築
ネル(N耳Eピダーマル成長因子(EGF)-Like;Nell2としても知られています)は、細胞外糖タンパク質です。トロンボスポンジン-1と構造的に類似しており、主に神経系で発現しています20,21。我々は以前に、Nelが網膜神経節細胞15の分化および生存を調節し、網膜軸索22、23、24に対する抑制誘導手がかりとして作用することを実証した。発生中のニワトリ網膜では、HH15の推定色素上皮でNel発現が検出されます(胚日(E)2.5)。HH20(E3.5)では、新たに分化した網膜神経節細胞でもNel発現が観察されます。色素上皮お.......
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ディスカッション
このプロトコルは、 in ovo エレクトロポレーションと Tol2 トランスポゾンシステムを用いた人工 miRNA のトランスジェニック発現による、発生中のニワトリ網膜における遺伝子サイレンシングの詳細なガイドを提供します。
この手法を正常に実行するには、次の要素が非常に重要です。まず、堅牢なノックダウン効果を発揮することが確認されているmiRNA配列を使用することが重要です。 それらをin ovo エレクトロポレーションに適用する前に、 in vitro アッセイで個々のpre-miRNA配列の遺伝子抑制効率をテストし(ステップ1.4)、最も高いノックダウン活性を示す2つのpre-miRNA配列を鎖鎖します(ステップ1.5)。第二に、DNA溶液を注入するためのマイクロピペット針を挿入するときに、視神経小胞および周囲の神経組織を損傷しないことが重要です。胚への過度の損傷は、胚の奇形や死につながる可能性があります。組織の損傷を避けるために、マイクロピペットを正しい向きで視神経小胞に導入します。マイクロピペット針の先端が小さく鋭利.......
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開示事項
著者は開示するものは何もありません。
謝辞
pT2K-CAGGSおよびpCAGGS-T2TPベクターは、それぞれ高橋佳子(京都大学、京都)および川上浩一(国立遺伝学研究所、三島)から提供された。原稿を批判的に読んでくれたマイケル・ベルベログルに感謝します。この研究は、王立協会およびバイオテクノロジーおよび生物科学研究評議会(BBSRC)(英国)からM.N.への助成金によってサポートされました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 18 G ニードル、2" | VWR | 89219-320 | |
| AP-TAG キット A および AP-TAG キット B | GenHunter Corp | Q201 および Q202 | AP 融合タンパク質 (https://www.genhunter.com/products/ap-tag-kit-a.html, https://www.genhunter.com/products/ap-tag-kit-b.html) |
| Block-iT RNAi Designer | Invitrogen | ターゲット配列を選択し、pre-miRNA配列を設計するためのオンラインツール(https://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/) | |
| BSA 10 mg | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| C115CBケーブル | Sonidel | C115CB | https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼254 |
| C117ケーブル | Sonidel | C117 | |
| https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼252 オメガドットファイバー付きキャピラリーチューブ(マイクロピペット針) | FHC | 30-30-1 | 1 mm O.D. 0.75 mm I.D |
| CUY21 方形波エレクトロポレーター | Nepa Gene | CUY21 | |
| ジエタノールアミン (pH 9.8) | Sigma-Aldrich | D8885 | |
| 解剖顕微鏡 | |||
| 卵インキュベーター | Kurl | B-Lab-600-110 | |
| https://www.flemingoutdoors.com/kuhl%2D%2D-600-egglaboratory-incubator%2D%2D-b-lab-600-110.html 電極ホルダー | Sonidel | CUY580 | https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼85 |
| Electrodes | Nepa Gene | CUY611P3-1 | https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼94 |
| Electromax DH10B | Invitrogen | 18290-015 | Electrocompetent E. coli細胞 |
| Fast green FCF | Sigma-Aldrich | F7258 | |
| 受精鶏卵(Gallus gallus) | 商業業者(Charles Riverなど)または地元の農家 | ||
| Gooseneck繊維光源 | |||
| FuGene 6トランスフェクション試薬 | Promega | E2691 | |
| ハミルトンシリンジ(50 μL) | Sigma-Aldrich | 20715 | Hamilton Cat No 80901 |
| ハンクス平衡塩溶液 | Sigma-Aldrich | H6648 | |
| 重鉱物油 | Sigma-Aldrich | 330760 | |
| HEPES | GIBCO | 15630080 | |
| L-ホモアルギニン | Sigma-Aldrich | H10007 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 13112 | |
| マイクロマニピュレーター | 成重 (日本) | MM3 | http://products.narishige-group.com/group1/MM-3/electro/english.html |
| マイクロピペットプーラー | シャッター装置 | P97 | |
| p-ニトロフェニルホスフェート | Sigma-Aldrich | 20-106 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8662 | |
| pCAGGS-T2TP ベクトル | Tol2トランスポゼース発現プラスミド。川上浩一さん(国立遺伝学研究所)からの寛大なご褒美です。Addgeneからもお買い求めいただけます。 | ||
| Pfu | ThermoFisher | F566S | |
| Picospritzer (オプション) | Parker | Pressure microinjection system | |
| Plasmid maxi kit | Qiagen | 12163 | Plasmid maxiprep kit |
| pT2K-CAGGS vector | Tol2 transposon vector.提供:高橋 佳子 (京都大学) | ||
| PVC tubing | VWR (UK) | 228-3830 | |
| Spectinomycin | Sigma-Aldrich | S9007-5 | |
| T4 DNA ligase | Promega | M1801 | |
| The BLOCK-iT Pol II miR RNA expression kit with EmGFP | Invitrogen | K493600 | miRNA発現ベクター(pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA)、コントロールベクター(pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-negativeコントロールプラスミド)、付属試薬、説明書(https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/K493600?SID.srch-hj-K4936-00) |
| サーマルサイクラー |
参考文献
- Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo. Biochemical and Biophysical Research Communications. 230, 376-380 (1997).
- Funahashi, J., et al.
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再版と許可
