Method Article

קונפוקלית לייזר סריקה מיקרוסקופיה מבוסס ניתוח כמותי של אספרגילוס פומיגטוס קונידיה ריאות עכבר נקי לחלוטין

DOI:

10.3791/62436

⸱

September 18th, 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Research Center for Molecular Mechanisms of Aging and Age-Related Diseases, Moscow Institute of Physics and Technology, 2Department of Immunology, Shemyakin and Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences, 3Institute of Biological Information Processing (IBI-7: Structural Biochemistry), Forschungszentrum Jülich

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מתארים את השיטה לניתוח כמותי של ההתפלגות של אספרגילוס פומיגאטוס קונידיה (3 מיקרומטר בגודל) דרכי הנשימה של עכברים. השיטה יכולה לשמש גם לניתוח של חלקיקים מיקרו חלקיקים וחלוקת ננו-חלקיקים בדרכי הנשימה במודלים שונים של מצב פתולוגי.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אספרגילוס פומיגאטוס קונידיה הם פתוגנים מוטסים שיכולים לחדור דרכי הנשימה האנושיות. אנשים אימונו-מוכשרים ללא אלרגיות מפגינים עמידות וסובלנות חיסונית, ואילו בחולים אימונו-קום, קונידיה יכולה ליישב דרכי הנשימה ולגרום להפרעות נשימה פולשניות חמורות. תאים שונים בתאי דרכי הנשימה השונים מעורבים בתגובה החיסונית המונעת פלישה פטרייתית; עם זאת, ההיבטים המרחבי-זמניים של חיסול פתוגן עדיין לא מובנים לחלוטין. הדמיה תלת ממדית (3D) של איברים בעלי הרכבה מלאה שנוקתה אופטית, במיוחד הריאות של עכברים ניסיוניים, מאפשרת זיהוי של פתוגנים בעלי תווית פלואורסצנטית בדרכי הנשימה בנקודות זמן שונות לאחר ההדבקה. במחקר הנוכחי, אנו מתארים התקנה ניסיונית לביצוע ניתוח כמותי של הפצת קונידיה A. fumigatus בנתיבי הנשימה. באמצעות מיקרוסקופיה סריקת לייזר קונפוקלית פלואורסצנטית (CLSM), איתרנו את המיקום של קונידיה שכותרתו פלואורסצנטית בענפי הסימפונות ובתא המכתשי 6 שעות לאחר יישום oropharyngeal לעכברים. הגישה המתוארת כאן שימשה בעבר לזיהוי מיקום הפתוגן המדויק וזיהוי התאים האינטראקטיביים של הפתוגן בשלבים שונים של התגובה החיסונית. ההתקנה הניסיונית יכולה לשמש להערכת הקינטיקה של חיסול הפתוגן בתנאים פתולוגיים שונים.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

על בסיס יומי, אנשים שואפים פתוגנים מוטסים, כולל נבגים של פטריות אופורטוניסטיות אספרגילוס פומיגאטוס (A. fumigatus conidia) שיכולים לחדור את דרכיהנשימה 1. דרכי הנשימה של היונקים היא מערכת של דרכי הנשימה של דורות שונים המאופיינים במבנים השונים של קירות דרכיהנשימה 2,3,4. קירות קנה הנשימה מורכבים ממספר סוגי תאים ביניהם תאים ססיליים המספקים את הסיווג הרירי5. ב alveoli, אין תאים ciliated ואת פתוגנים בחלל המצף חודר לא ניתן לחסל על ידי אישור רירית6. יתר על כן, כל ייצור דרכי הנשימה הוא נישה עבור א....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל השיטות הנוגעות לחיות מעבדה המתוארות כאן אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש (IACUC) במכון שמיאקין ואובצ'יניקוב לכימיה ביואורגנית, האקדמיה הרוסית למדעים (פרוטוקול מספר 226/2017).

1. א. יישום קונידיה של פומיגטוס

  1. כדי להשיג פלואורסצנטית שכותרתו A. fumigatus conidia, לתקן 5 × 108 conidia על ידי הוספת 1 מ"ל של 3% paraformaldehyde לכדור conidia. דגירה במבחנה של 50 מ"ל למשך 2 שעות על שייקר בטמפרטורת החדר.
  2. לשטוף conidia עם 20 מ"ל של תמיסת מלח חוצץ פוספט (PBS): צנטריפוגה ב 1,000 x g במשך 15 דקות, בעדינות להסיר את supernatant, ולהוסיף PBS טרי בנפח של 20 מ"ל. חוזר.
  3. להמיס את ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בעקבות הפרוטוקול לעיל, התמונה 3D מראה את דרכי הנשימה ו A. fumigatus conidia באונה הריאות של עכבר הושגה (איור 1A). סטרפטאבידין (ששימש להדמיה של דרכי הנשימה) שכותרתו סימפונות וסימפונות15. בנוסף, כלי השיט הגדולים, שניתן להבחין ביניהם בקלות מדבורי הנשימה על ידי המורפולוגיה שלהם, ופלורה מוצגים בערוץ דרכי הנשימה (איור 1A-C). יצירת פני השטח והמסכה של דרכי הנשימה אפשרו הסרה של כלי השיט והתחזיות pleura בערוץ דרכי הנשימה; .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הדמיה תלת-ממדית של איבר שלם מאפשרת קבלת הנתונים ללא ניתוח של הדגימה, שהיא בעלת חשיבות רבה לחקירת ההיבטים המרחביים של ההתפלגות האנטומית של הפתוגן באורגניזם. ישנן מספר טכניקות ושינויים של ניקוי אופטי רקמה המסייעים להתגבר על פיזור אור הלייזר ולאפשר הדמיה של איברים שלמים15,16,18,19. אחת הגישות מותאמות אישית לניקוי רקמות מורכבת מהתייבשות רקמות מבוססת מתנול והתזות ואחריה ניקוי אופטי עם BABB. הגישה פו.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אינם מדווחים על ניגודי עניינים בעבודה זו.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מודים לפרופ' סוון קרפמן (בית החולים האוניברסיטאי ארלנגן ו-FUA ארלנגן-נורנברג, גרמניה) על אספקת זן הקונידיה אספרגילוס פומיגטוס AfS150. המחברים מודים למשרד העיתונות MIPT. V.B. מכיר משרד המדע וההשכלה הגבוהה של הפדרציה הרוסית (#075-00337-20-03, פרויקט FSMG-2020-0003). העבודה לגבי הדמיה וכימות של קונידיה A. fumigatus נתמכה על ידי RSF No 19-75-00082. העבודה לגבי הדמיית דרכי הנשימה נתמכה על ידי RFBR No 20-04-60311.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Alexa Fluor 594 NHS EsterThermoFisherA20004
Aspergillus fumigatus conidiaATCC46645הזן AfS150, נגזרת ATCC 46645
בנזיל אלכוהולPanreac141081.161198.0-100 %
בנזיל בנזואטAcrosAC10586-001099+%
C57Bl/6 עכבריםPushchino Animal מרכז רבייה (רוסיה)זכר. בן 12 - 30 שבועות.
צנתרVenisystemsG715-A0118G
כיסוי הדמיה תא זכוכית תחתוןEppendorf30742028תא באר 4 או 8 עם צנטריפוגה תחתונה מזכוכית כיסוי
Eppendorf5804Rכל צנטריפוגה המסופקת 1000 גרם ניתן להשתמש
במיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקליZEISSZEISS LSM780
דימתיל סולפוקסידסיגמא-אולדריץ'276855≥ 99.9%
חבילת עיבוד תמונה FIJIתוכנה חופשיתFIJI
מלקחייםB. Braun AesculapBD557R
מלקחייםB. Braun AesculapBD321R
מלקחייםBochem1727
בקבוק זכוכיתDURAN242101304עם מכסה טחון
עורך גרפי פוטושופAdobe IncAdobe Photoshop CS
GraphPad SoftwareGraphPadPrism 8
Imaris Microscopy Imaging SoftwareOxford Instrumentsגרסת ניסיון חינם זמינה https://imaris.oxinst.com/microscopy-imaging-software-free-trial
IsofluraneKarizoo
NaHCO3Panreac141638
מטרהZEISS420640-9800-000  Plan-Apochromat, 10 & times; (NA = 0.3)
פרפורמלדהידסיגמא-אולדריץ'158127
PBSPanecoP060Π
פיפטהProLine7220205 עד 50 μ L
אבקת חלבRothT145.2
מערבל לדוגמאמספריים DynalMXIC1
B. BraunBC257Rשייקר קהה
ApexlabGS-2050-300 סל"ד
SkalpelBochem12646
חוט משיB. בראון3 USP
סטרפטווידין, Alexa Fluor 488 מצומדThermoFisherS11223
מבחנהSPL Lifesciences5005050 מ"ל
טריס (הידרוקסימתיל אמינומתאן)הליקוןH-1702-0.5  מר 121.14; מספר CAS: 77-86-1
Triton X-100AmrescoAm-O694-0.1
תוכנת מיקרוסקופ ZENZEISSZEN2012 SP5https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/microscope-software/zen.html
עם שיניים עדינים חלק :

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. O'Gorman, C. M. Airborne Aspergillus fumigatus conidia: A risk factor for aspergillosis. Fungal Biology Reviews. 25 (3), 151-157 (2011).
  2. Hyde, D. M., et al. Asthma: A comparison of animal models using stereological methods. European Re....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Confocal Laser MicroscopyAspergillus Fumigatus ConidiaOptical ClearingMouse Lung ImagingQuantitative AnalysisAirway DistributionThree Dimensional ImagingSpectral UnmixingAirway MaskingImmune Response

Related Articles