우리는 마우스 perigonadal 지방 조직 및 인간 혈장에서 분리된 세포외 소포의 크기 분포 및 총 입자 농도를 추정하기 위하여 새로운 나노 입자 추적 분석 계기를 사용하는 방법을 보여줍니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
이 논문에서
요약
초록
세포 외 소포 (EV)의 생리학적 및 병리학적 역할은 점점 더 인식되고 있으며, EV 분야는 빠르게 진화하는 연구 영역으로 만듭니다. EV 격리를 위한 다양한 방법이 있으며, 각각 은하류 수율과 EV순도에 영향을 미치는 고유한 장점과 단점이 있습니다. 따라서 선택한 방법에 의해 지정된 소스로부터 분리된 EV 준비의 특성화는 다운스트림 결과를 해석하고 실험실 전체의 결과를 비교하는 데 중요합니다. 질병 상태에 의해 또는 외부 조건에 응하여 변경될 수 있는 전기 의 크기와 양을 결정하기 위한 각종 방법이 존재합니다. 나노 입자 추적 분석 (NTA)은 개별 EV의 높은 처리량 분석에 사용되는 저명한 기술 중 하나입니다. 여기서, 우리는 현장에서 주요 발전을 나타내는 NTA에 대한 획기적인 기술을 사용하여 마우스 페리고나달 지방 조직 및 인간 플라즈마로부터 분리 된 전기 의 정량화 및 크기 측정을위한 상세한 프로토콜을 제시합니다. 결과는 이 방법이 전송 전자 현미경검사법에 의해 확인된 바와 같이 다른 방법을 사용하여 다른 소스로부터 분리된 전기에 대한 재현 가능하고 유효한 총 입자 농도 및 크기 분포 데이터를 제공할 수 있음을 보여준다. NTA에 대한이 악기의 적응은 EV 연구에서 엄격과 재현성을 높이기 위해 NTA 방법의 표준화의 필요성을 해결합니다.
서론
세포외 소포(Ev)는 거의 모든 세포 유형 1에 의해 분비되는 작은 (0.03-2 μm) 막 결합소포이다. 그들은 종종 방출 및 크기2의그들의 기계장치에 따라 "엑소좀", "microvesicles" 또는 "apoptotic 바디"로 불립니다. 처음에는 전기자동차가 항상성을 유지하기 위해 세포에서 폐기물을 제거하는 수단이라고생각되었지만,우리는 이제 DNA, RNA(mRNA, microRNA), 지질 및 단백질4,5를 포함한 분자 물질의 전송을 통해 세포간 통신에 참여할 수 있다는 것을 알고 있으며, 정상 생리학뿐만 아니라 정상적인 생리학의 중요한 조절제라는 것을알고 있습니다. 5,6,7,8.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
이러한 샘플의 모든 작업은 기관 동물 관리 및 사용 위원회 및 기관 검토 위원회 지침에 따라 수행되었습니다. NTA 메서드에 대한 회로도 개요는 도 2에묘사됩니다.
그림 2: 입자 추적 기기를 사용하는 NTA 메서드개요입니다. 샘플은 준비되고 기기에 삽입됩니다. NTA 소프트웨어가 열리고, 기록 매개 변수가 조정되고, 샘플에 초점을 맞췄다. 그런 다음 데이터가 기록, 처리 및 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
1. 세포 외 소포 격리
참고: 마우스....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
이 데모 전에, 계측기의 교정은 폴리스티렌 비드 표준의 크기 분포를 측정하여 획득 된 데이터의 유효성을 보장하기 위해 먼저 테스트되었습니다. 기본 기록 매개 변수및 이 프로토콜에 권장되는 처리 설정을 사용하여 100nm 및 400 nm 구슬의 크기 분포를 테스트했습니다(그림8).
100 nm 폴리스티렌 비드 표준의 경우 4.205 x 107 입자 /mL의 농도를 측정하였다. 평균(표준 편차, SD) 크기는 0.16의 변동계수(CV)를 가진 102(±17) nm이었다. D10/D50/D90 값은 76/104/126 nm였습니다. 이는 입자 추적 기기가 100nm 단분산 구슬의 크기를 정확하게 보고했음을 나타냅니다. 400 nm 폴리스티렌 비드 표준의 경우 농도는 4.365 x 107 입자 / mL이었습니다. 평균(SD) 크기는 391(±47) nm, 이력서는 0.12였다. D10/D50/D.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
여기서, 우리는 다양한 입자 크기의 크기 분포를 동시에 측정하고 다분산 샘플에서 총 EV 농도를 측정하는 NTA의 NTA 프로토콜을 시연한다. 이 연구에서는 마우스 페리고나달 지방 조직과 인간 혈장이 EV의 공급원으로 사용되었습니다. 그러나, 혈청, 소변, 타액, 모유, 양수 및 세포 배양 과 같은 다른 조직 또는 생물학적 유체로부터 분리된 전기자동차도 NTA에 사용될 수 있다. 폴리스티렌 비드 표준의 측정은 계측기를 적절하게 보정하고 이 NTA 계측기가 나노 입자 ≤ 400 nm의 크기를 정확하게 측정할 수 있음을 입증했습니다. 마우스 조직 EV 샘플의 다양한 희석을 테스트하였다. 도 9에도시된 바와 같이, 보고된 입자 농도는 예상대로 희석 계수와 함께 스케일링되며, 이는 계측기가 기술적 복제 간의 가변성이 거의 없는 다양한 희석제에서 입자 농도를 정확하게 검출할 수 있음을 입증한다. 그러나, 이것은 계측기의 작동 범위 내에서 입자 농도로 작업할 때였습니다(mL당 5 x 1.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
모든 저자는 이해 상충이 없다고 선언했다.
감사의 글
이 작품은 국립 보건원 (ES030973-01A1, R01ES025225, R01DK066525, P30DK026687, P30DK063608)에 의해 지원되었습니다. 우리는 제프리 바디콤, 호리바 인스트루먼트 박사, 악기 를 보정하는 그의 도움을 위해 통합 인정합니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 1X dPBS | VWR | 02-0119-1000 | 시료 희석 |
| 100nm 비드 표준 | Thermo Scientific | 3100A | ViewSizer 3000 보정 |
| 400nm 비드 표준 | Thermo Scientific | 3400A | ViewSizer 3000 보정 테스트 |
| 원심 필터 유닛 | Amicon | UFC901024 | PBS 희석제 |
| 여과 수집 튜브, 2mL | Qiagen | 19201 | 인간 플라즈마 세포 외 소포의 격리 |
| 압축 공기 살포기 | DustOff | DPSJB-12 | 큐벳 청소 |
| 큐벳 인서트 | HORIBA Scientific | - | ViewSizer 3000 |
| 큐벳 지그 | HORIBA Scientific | 구매 | 벳 내부에 인서트를 배치하면서 마그네틱 교반 막대를 정렬합니다. ViewSizer 3000 |
| 탈이온수 | VWR | 02-0201-1000 | 큐벳 청소 |
| 모니터, 키보드, 마우스 및 필요한 모든 케이블이 있는 데스크탑 컴퓨터 | Dell | - | ViewSizer 3000 구매 시 |
| 제공 에탄올(70-100%) | Millipore Sigma | - | 큐벳 청소 |
| ExoQuick ULTRA | System Biosciences | EQULTRA-20A-1 | 인간 플라즈마 세포외 소포체 분리용 |
| 뚜껑이 있는 유리 섬광 바이알 | Thermo Scientific | B780020 | 큐벳 세척 방법 |
| ViewSizer 3000 | 후크" 도구 | ||
| 벳 세척 및 작업 표면 커버용 | |||
| 마이크로 원심분리기 튜브, 2 mL | Eppendorf | 22363344 | 인간 플라즈마 세포 외 소포체 분리를 위해 |
| Stir bar | Sp Scienceware | F37119-0005 | |
| Suprasil 석영 큐벳 (캡 포함 | Agilent Technologies | AG1000-0544 | ViewSizer 3000 |
| ViewSizer 3000 | HORIBA | Scientific-Nanoparticle | 추적 기기 |
참고문헌
- Colombo, M., Raposo, G., Théry, C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 255-289 (2014).
- Hessvik, N. P., Llorente, A.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
