Een biomembrane force probe (BFP) is een in situ dynamic force spectroscopy (DFS) techniek. BFP kan worden gebruikt om de veerconstante van moleculaire interacties op levende cellen te meten. Dit protocol presenteert veerconstante analyse voor moleculaire bindingen gedetecteerd door BFP.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Moleculaire veerconstante analyse door biomembrane force probe spectroscopie
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Een biomembrane force probe (BFP) is onlangs naar voren gekomen als een native-cell-surface of in situ dynamic force spectroscopy (DFS) nanotool die single-molecular binding kinetics kan meten, mechanische eigenschappen van ligand-receptor interacties kan beoordelen, eiwitdynamische conformatieveranderingen kan visualiseren en receptor gemedieerde celmechanosensingmechanismen spannender kan ophelderen. Meer recent is BFP gebruikt om de veerconstante van moleculaire bindingen te meten. Dit protocol beschrijft de stapsgewijze procedure voor het uitvoeren van moleculaire veerconstante DFS-analyse. Specifiek worden twee BFP-werkingsmodi besproken, namelijk de Bead-Cell- en Bead-Bead-modi. Dit protocol richt zich op het afleiden van veerconstanten van de moleculaire binding en cel uit DFS-ruwe gegevens.
Inleiding
Als een live-cell DFS-techniek ontwikkelt BFP een menselijke rode bloedcel (RBC; Figuur 1) in een ultragevoelige en afstembare krachtopnemer met een compatibel veerconstantebereik bij 0,1-3 pN/nm1,2,3. Om ligand-receptorinteractie te onderzoeken, maakt BFP DFS-metingen mogelijk bij ~ 1 pN (10-12 N), ~ 3 nm(10 -9 m) en ~ 0,5 ms (10-3 s) in kracht, ruimtelijke en temporele resolutie4,5. De experimentele configuratie bestaat uit twee tegengestelde micropipett....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Analyseerbare DFS-gebeurtenissen verkrijgen
- Start het experiment in de software (bijv. LabVIEW VI) voor de BFP-besturing en parameterinstelling(Figuur S1A).
- Observeer de repetitieve sonde kraal-target kraal / cel aanrakingen in de software voor BFP Monitor(Figuur S1B).
- Test en bereik de adhesiefrequentie ≤ 20% binnen de eerste 50 aanrakingen door de impingementkracht en contacttijd af te stemmen, waardoor het ervoor zorgt dat ≥ 89% van de DFS-adhesiegebeurtenis wordt gemedieerd door enkele bindingen12,13,14.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
In dit werk hebben we het protocol van de BFP veerconstante analyse gedemonstreerd. Voor de Bead-Cell-analysemodus analyseerden we de kmol van de moleculaire binding tussen het geglycosyleerde eiwit Thy-1 gecoat op de Probe-kraal en het integrine-α5β1 uitgedrukt op de Target K562-cel (Thy-1-integrine α5β1; Figuur 3A) 10. Dek-cel is ook afgeleid van de Bead-Cell-modus (K562-cel;
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Samenvattend hebben we een gedetailleerd data-analyseprotocol geleverd voor het voorbewerken van de DFS-ruwe gegevens en het afleiden van moleculaire veerconstanten in de BFP Bead-Bead en Bead-Cell analysemodi. Biomechanische modellen en vergelijkingen die nodig zijn voor het bepalen van moleculaire en cellulaire veerconstanten worden gepresenteerd. Hoewel verschillende integrinen worden bestudeerd, heeft de kmol gemeten door de Bead-Bead-modus en de Bead-Cell-modus significante bereiksverschillen ( F.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat ze geen tegenstrijdige belangen te melden hebben met betrekking tot de huidige studie.
Dankbetuigingen
We bedanken Guillaume Troadec voor de nuttige discussie, Zihao Wang voor hardwareconsultatie en Sydney Manufacturing Hub, Gregg Suaning en Simon Ringer voor ondersteuning van onze labstart-up. Dit werk werd ondersteund door het Australian Research Council Discovery Project (DP200101970 - L.A.J.), NSW Cardiovascular Capacity Building Program (Early-Mid Career Researcher Grant - L.A.J.), Sydney Research Accelerator prize (SOAR - L.A.J.), Ramaciotti Foundations Health Investment Grant (2020HIG76 - L.A.J.), National Health and Medical Research Council Ideas Grant (APP2003904 - L.A.J.), en The University of Sydney Faculty of Engineering Startup Fund and Major Equipment Sch....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 3-Mercaptopropyltrimethoxysilane (MPTMS) | Uct, Specialties, llc | 4420-74-0 | Functionalisering van glazen bolletjes |
| Anhy. Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S7907 | Bereiding van fosfaatbuffer |
| BFP data acquisition VI | LabVIEW | BFP controle en parameterinstelling | |
| BFP data analysis VI | LabVIEW | BFP grondgegevensanalyse | |
| Biotin-PEG3500-NHS | JenKem | A5026-1 | RBC biotinylering |
| Borosilicate Glass beads | Distrilab Particle Technology, Netherlands | 9002 | Functionalisering van glazen bolletjes |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A0336 | Ligand functionalisering |
| Camera VI | LabVIEW | BFP monitoring | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | Bereiding van Tyrode’s buffer |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H3375 | Bereiding van Tyrode’s buffer |
| MAL-PEG3500-NHS | JenKem | A5002-1 | Functionalisering van glazen bolletjes |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | Bereiding van Tyrode’s buffer |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | Bereiding van koolzuur/bicarbonaatbuffer; bereiding van Tyrode’s buffer |
| Sodium Carbonate (Na2CO3) | Sigma-Aldrich | S2127 | Bereiding van koolzuur/bicarbonaatbuffer |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | Bereiding van Tyrode’s buffer |
| Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate (NaH2PO4•H2O) | Sigma-Aldrich | S9638 | Bereiding van fosfaatbuffer |
| Streptavidin-Maleimide | Sigma-Aldrich | S9415 | Functionalisering van glazen bolletjes |
Referenties
- Chen, Y., et al. Fluorescence Biomembrane Force Probe: Concurrent Quantitation of Receptor-ligand Kinetics and Binding-induced Intracellular Signaling on a Single Cell. The Journal of Visualized Experiments. (102), e52975(2015).
- Su, Q. P., Ju, L. A.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
