المورفولوجيا التشجرية العصبية غالبا ما تكمن وراء وظيفة. في الواقع، العديد من العمليات المرض التي تؤثر على تطوير الخلايا العصبية تظهر مع النمط الظاهري المورفولوجي. يصف هذا البروتوكول طريقة بسيطة وقوية لتحليل المشجرات التشجرية السليمة والعمود الفقري المرتبط بها.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
التصوير والتحديد الكمي للتشعبات العصبية السليمة عن طريق إزالة الأنسجة الوضوح
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يتم تحديد نشاط الدماغ ، والإشارات الكهروكيميائية التي تنتقل بين الخلايا العصبية ، من خلال أنماط الاتصال في شبكات الخلايا العصبية ، ومن مورفولوجيا العمليات والهياكل الفرعية داخل هذه الخلايا العصبية. على هذا النحو، نشأ الكثير مما هو معروف عن وظيفة الدماغ جنبا إلى جنب مع التطورات في تقنيات التصوير التي تسمح بمزيد من البصيرة في كيفية تنظيم الخلايا العصبية وتوصيلها في الدماغ. وقد سمحت التحسينات في تطهير الأنسجة للتصوير عالي الدقة لشرائح الدماغ السميكة، مما يسهل إعادة البناء المورفولوجي وتحليل الهياكل الفرعية العصبية، مثل المشجرات والعمود الفقري. جنبا إلى جنب ، والتقدم في برامج معالجة الصور توفير أساليب لتحليل مجموعات البيانات بسرعة التصوير الكبيرة. يقدم هذا العمل طريقة سريعة نسبيا لمعالجة وتصور وتحليل شرائح سميكة من الأنسجة العصبية المسماة بدقة عالية باستخدام إزالة الأنسجة CLARITY ، والتنظير المجهري confocal ، وتحليل الصور. سيسهل هذا البروتوكول الجهود الرامية إلى فهم أنماط الاتصال ومورفولوجيا الخلايا العصبية التي تميز الأدمغة السليمة، والتغيرات في هذه الخصائص التي تنشأ في حالات الدماغ المريضة.
المقدمة
فهم التنظيم المكاني، وأنماط الاتصال، ومورفولوجيا الهياكل البيولوجية ثلاثية الأبعاد المعقدة أمر ضروري لتحديد وظائف خلايا وأنسجة محددة. وهذا صحيح بشكل خاص في علم الأعصاب، حيث تم تكريس جهد هائل لبناء خرائط عصبية تحليلية عالية الدقة للجهاز العصبي المركزي1،2. الفحص الدقيق للخلايا العصبية التي تتألف منها هذه الخرائط تسفر عن مورفولوجيا متنوعة، مع الاتصالات والمواقع التي تعكس وظيفة هذه المجموعات المتنوعة من الخلايا العصبية3،4. وعلاوة على ذلك، التحقيق في الهياكل دون الخلوية، وخاصة العمود الفقري التشجر، يمكن أن تبلغ نضج نقاط الاشتباك العصبي، وبالتالي تعكس عمليات....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
يتبع البروتوكول التالي جميع إرشادات رعاية الحيوان لكلية بايلور للطب.
1. تشريح وإعداد الأنسجة
- قتل رحيم الماوس مع جرعة زائدة من isoflurane عن طريق وضع الماوس في حاوية مغلقة مع منشفة غارقة في isoflurane (أو من قبل وسائل أخرى وافق IUCAC).
- Perfuse الحيوان عبر البطاقة باستخدام إبرة 25 G مع 10 مل من الجليد البارد PBS، تليها 10 مل من 4٪ PFA.
- تشريح منطقة الدماغ (أو الأنسجة) من الفائدة.
- ضع الأنسجة المتشرخة في 4٪ PFA بين عشية وضحاها عند 4 درجة مئوية. التثبيت الصحيح هو المفتاح لهذا البروتوكول. لا تخطي أو تقصير هذه الخطوة.
- بعد التثبيت في 4٪ PFA لمدة 12 ساعة على الأقل، نقل الأنسجة إلى خليط هيدروجيل الأكر....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
بعد الحصول على الصورة ، تم تحليل مورفولوجيا الخلية التمثيلية باستخدام إحصاءات مضمنة وتصنيف البرامج النصية داخل برنامج التحليل. البيانات التي تم جمعها(الشكل 6A)يعكس أن الخلايا العصبية 2 لديها بنية أكبر dendritic مع كثافة أعلى من العمود الفقري. ككل، تشير البيانات إلى أن الخلايا العصبية 2 لديها بنية أكثر تعقيدا التشجر مقارنة مع الخلايا العصبية 1. لإثبات هذه النتيجة، تم إجراء تحليل شول القياسية، مما يؤكد أن الخلايا العصبية 2 هو أكثر تعقيدا dendritically من الخلايا العصبية 1 كما يدل على ذلك زيادة.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
قبل ظهور تقنيات إزالة الأنسجة المعاصرة ، كانت دراسة مورفولوجيا الخلايا العصبية تتكون من قسم مكثف الوقت والتصوير وإعادة بناء الأجزاء الرقيقة جدا المجاورة. باستخدام تطهير الأنسجة الكهربائية في تركيبة مع التصوير confocal يوفر وجهة نظر دون عائق من مورفولوجيا الخلايا العصبية كاملة. من الأشجار التغصنية سليمة، وصولا الى أصغر بوتون متشابك، والتصوير وتحديد مورفولوجيا الخلايا العصبية لم يكن أبدا أكثر جدوى.
إعداد أنسجة الدماغ مسح واضحة ويتطلب قطعة واحدة فقط من المعدات المتخصصة. الأنسجة مسح وصورت باستخدام.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه في هذا الوقت.
شكر وتقدير
نود أن نشكر NRDDC الأساسية الفيروسية في معهد جان ودان دنكان العصبي لإنتاج AAVs والفيروسات العدسية المستخدمة في هذه التجارب. بالإضافة إلى ذلك، نود أن نشكر مركز كلية بايلور للطب المقارن تربية الفئران والصيانة العامة للفئران المستخدمة. نود أن نشكر جمعية القلب الأمريكية على دعمها بموجب الجائزة رقم 20PRE35040011 ، و BRASS: Baylor دعاة البحوث للطلاب العلماء لدعمهم (PJH). وأخيرا، نود أن نشكر Logos على تزويد مختبرنا بنظام إزالة الأنسجة الكهربائية X-Clarity.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 15 مل أنبوب مخروطي | حراري علمي | 339650 | |
| 25 جم × 1 بوصة إبرة | BD | 305127 | |
| 30٪ أكريلاميد (بدون مكرر) التشخيص | الوطني | EC-810 | |
| 50 مل أنبوب مخروطي | حراري علمي | 339653 | |
| محلول تطهير الأنسجة الكهربية | شعارات | C13001 | |
| Histodenz | مجموعة حلول الهيدروجيل Sigma | D2158-100G | |
| شعارات | C1310X | ||
| Imaris | Oxford Instruments | N / A | |
| Paraformaldehyde 16٪ | EMS | 15710 | |
| PBS ، 1x ، 500 مل ، 6 زجاجات / علبة | فيشر | MT21040CV | |
| VA-044 | واكو | 925-41020 | |
| X-CLARITY شعارات نظام البلمرة | C20001 | ||
| X-CLARITY نظام إزالة الأنسجة II | شعارات | C30001 |
المراجع
- Abbott, L. F., et al. The Mind of a mouse. Cell. 182 (6), 1372-1376 (2020).
- White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philosophical transactions o....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
