מודל של סטאטוזיס ניסיוני במבחנה: תרבית תאי הפטוציט במדיום מותנה בעומס יתר של שומנים

Summary

פרוטוקול זה נועד להיות כלי לחקר סטאטוזיס ואת השינויים המולקולריים, הביוכימיים, התאיים המיוצרים על ידי חשיפה יתר של hepatocytes שומנים במבחנה.

Abstract

מחלת כבד שומני (MAFLD), הידועה בעבר כמחלת כבד שומני לא אלכוהולית (NAFLD), היא מחלת הכבד השכיחה ביותר בעולם בשל הקשר שלה עם השמנת יתר, סוכרת מסוג 2, ודיסליפידמיה. סטאטוזיס כבד, הצטברות של טיפות שומנים בדם בפרנצ'ימה בכבד, היא תכונה מרכזית של המחלה שקדמה לדלקת שנצפו בteatohepatitis, פיברוזיס, ומחלת כבד סופנית. הצטברות שומנים בדם בהפטוציטים עלולה להפריע לחילוף חומרים תקין של קסנוביוטיקה ומולקולות אנדוגניות, כמו גם לגרום לתהליכים תאיים המובילים להתקדמות המחלה. למרות המחקר הניסיוני של steatosis יכול להתבצע vivo, במבחנה גישות לחקר steatosis הם כלים משלימים עם יתרונות שונים. תרבות hepatocyte במדיום מותנה עומס יתר שומנים היא אפשרות רבייה מצוינת לחקר הסטאטוזיס הכבד המאפשר זיהוי של תהליכים תאיים הקשורים הצטברות שומנים, כגון לחצים חמצוניים ורשתית, autophagia, התפשטות, מוות תאים, וכו ', כמו גם בדיקות אחרות כולל יעילות סמים, ובדיקות טוקסיקולוגיות, בין יישומים אפשריים רבים אחרים. כאן, הוא נועד לתאר את המתודולוגיה של תרבית התא hepatocyte במדיום מותנה עומס יתר שומנים. תאי HepG2 היו בתרבית RMPI 1640 בינוני מותנה עם נתרן פלמיטט ונתרן oleate. חשוב לציין, היחס של שני שומנים אלה חיוני כדי להעדיף הצטברות טיפת שומנים בדם, תוך שמירה על התפשטות התאים ושיעור תמותה מתון, כפי שקורה בכבד במהלך המחלה. המתודולוגיה, מהכנת מלאי פתרון השומנים, תערובת, תוספת לתרבות הבינונית וההפטוציט מוצגת. עם גישה זו, ניתן לזהות טיפות שומנים בדם בהפטוציטים שניתן להבחין בהם בקלות על ידי כתמי O אדומים שמן, כמו גם עקומות של שיעורי התפשטות / תמותה.

Introduction

כבד שומני הקשורים בתפקוד המטבולי נפוץ מאוד ברחבי העולם^1,2; ההערכה היא כי עד 25% מהאוכלוסייה מושפע³. מחלה זו הידועה בעבר בשם מחלת כבד שומני לא אלכוהולי (NAFLD), עדכנה את המינוח שלה לתפקוד מטבולי הקשור למחלת כבד שומני (MAFLD) כדי לשקף במדויק את הפתוגנזה הקשורה להשמנת יתר, תנגודת לאינסולין, סוכרת מסוג 2, ודיסליפידמיה, כמו גם את ההנהלות האפשריות של המחלה^3,4.

ללא קשר לשם, המחלה כוללת קשת רחבה של שינויים היסטופתולוגיים המאופיינת בהצטברות גבוהה באופן חריג של שומנים בכבד (>5% מהשומן בהפטוציטים

Protocol

1. הכנה בינונית סטנדרטית ומותנית

1. כדי להכין RPMI 1640 סטנדרטי, תוספת RPMI 1640 תרבות בינוני עם 10% (v/ v) של סרום בקר עוברי (FBS, בעבר חום מומת) ו 1% (v/v) של פתרון פניצילין-סטרפטומיצין. לאחסן את המדיום ב 4 °C.עיקור באמצעות מסנני 0.22 מיקרומטר.
2. להכנת פתרון מלאי פלמיטט, להכין פתרון 50 mM של פלמיטט RPMI 1640 סטנדרטי בעבר בתוספת עם 1% אלבומין סרום בקר (ללא שומנים). נפח של 5-10 מ"ל של מלאי זה יהיה מספיק. לחטא את פתרון המלאי באמצעות מסנני 0.22 מיקרומטר. יש לאחסן ב-4 °C (50°F) המוגנים מפני אור למשך עד חודש אחד.
3. כדי להכין פתרון מלאי oleate, להכין פתרון 50 mM של oleate RPMI 1640 סטנדרטי בתוספת בעבר עם 1% אלבומין סרום בקר (ללא שומנים). נפח של 10 מ"....

Results

Hepatocytes מתורבת בצמיחת התצוגה הבינונית steatogenic על פני השטח של הבאר; עם זאת, hepatocytes שומן להראות שיעור צמיחה נמוך יותר בהשוואה לתאים בתרבית בינונית שליטה. היחס והריכוז המוצעים של OA ו- PA, מבטיחים הישרדות תאים במהלך התרבות. זריעת 1 x 10⁵ תאים לבאר בלוחות של 24 בארות מספקת מפגש אופטימלי כפי שמוצג באיור 1.

הכדאיות בתאים בתרבית הייתה נמוכה יותר בקבוצות steatogenic, מתון וקשה, בהשוואה לתנאי הבקרה. למעשה, הכדאיות פחתה בהדרגה ככל שזמן התרבות גדל, וה.......

Discussion

פרוטוקול זה נועד לספק אסטרטגיה לחקר סטאטוזיס במבחנה. תרבית התאים היא כלי רב עוצמה לחקר היבטים תאיים, מולקולריים, ביוכימיים וטוקסיקולוגיים של התאים החשופים לתנאים שונים. עם גישה זו, ניתן לדמיין סטאטוזיס לא רק כשלב של המחלה המורכבת שהיא MAFLD, אלא גם כמו חשיפת יתר hepatocyte שומנים ואת התוצאות האפשריות הנובעות מחשיפה כזו. לכן, היישום שלה אינו מוגבל לפיזיופתולוגיה של MAFLD, אלא לעובדה כי חולים עם כבד שומני חשופים תרופות טיפוליות, מזהמים, בין תנאים אחרים שעלולים להיות מושפעים סטאטוזיס. לכן, פרוטוקול זה יש יישומים פו.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ארון בטיחות ביולוגית	ESCO Airstream	AC2-452+C2:C26	Class II  סוג A2  ארון בטיחות ביולוגי
בקבוק מסנן עליון	קורנינג, ארה"ב	430513	לא פירוגני, פוליסטירן, סטרילי. 1 מסנן/שקית. 0.22 μ מ', 500 מ"ל.
סרום בקר albimun (BSA)	Gold Biotechnology, US	A-421-10	BSA חומצות שומן ללא תרבית תאים מדיה לתרבית תאים
RPMI 1640	ThermoFisher-Gibco, US	31800-022-סרום
בקר עוברי (FBS)	ThermoFisher-Gibco, ארה"ב
A4766801-Hemocytometer	Marienfeld, DE	640010-HepG2
קו תאים	ATCC, US	HB-8065	קרצינומה של הכבד תאים אנושיים.
חממה לחה	Thermo Electronic Corporation, ארה"ב	דגם: 3110	טמפרטורה (37 & deg; C ± 1 & deg; C), לחות (90% ± 5%) , CO2 (5% ± 1%)
מיקרוסקופ הפוך Eclipse	NIKON, JPN	דגם: TE2000-S-Isopropanol
	Sigma-Aldrich, US	I9030-4L-Oil
Red O Kit	Abcam, US	ab150678	ערכה להדמיה היסטולוגית של שומן ניטרלי.
פרפורמלדהיד	סיגמא-אולדריץ', ארה"ב	P6148-500G-פניצילין
/סטרפטומיצין	ThermoFisher-Gibco, ארה"	15140-122	אנטיביוטיקה 10,000 U/mL פניצילין, 10,000 μ גרם / מ"ל מד pH סטרפטומיצין
	בקמן, ארה"ב	דגם: 360 PH/Temp/MV	Meter-Phosphate
buffered Salt	ThermoFisher-Gibco, US	10010-023-פיפטות
סרולוגיות	Sarstedt, AUS	86.1253.001	לא פירוגני, סטרילי, 5 מ"ל
פיפטות סרולוגיות	Sarstedt, AUS	86.1254.001	לא פירוגני, סטרילי, 10 מ"ל
נתרן ביקרבונט	סיגמא-אולדריץ', ארה"	S5761-1KG	הכנת מצע תרבית
נתרן אולאט	סנטה קרוז ביוטכנולוגיה, ארה"ב	sc-215879A-נתרן
פלמיטט	סנטה קרוז ביוטכנולוגיה, ארה"ב	sc-215881-מסנן
מזרק	קורנינג, ארה"	431219	לא פירוגני, סטרילי, 28 מ"מ, 0.2 μm.
Trypan Blue	Sigma-Aldrich, US	T6146-25G-Trypsin
0.05% /EDTA 0.53 מ"מ	קורנינג, ארה"ב	25-052-Cl-24
אשכול תרבית תאים באר	קורנינג, ארה"ב	3524	תחתית שטוחה עם מכסה. תרבית רקמות מטופלת. לא פירוגני, פוליסטירן, סטרילי. 1/חבילה.
אשכול תרבית תאים 96 באר	קורנינג, ארה"ב	3599	תחתית שטוחה עם מכסה. תרבית רקמות מטופלת. לא פירוגני, פוליסטירן, סטרילי. 1/חבילה.