В этой статье описывается метод на основе магнитной левитации, который может специфически обнаруживать присутствие антигенов, растворимых или связанных с мембраной, путем количественной оценки изменений высоты левитации бусин захвата с фиксированной плотностью.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Количественная оценка клеточных плотностей и антигенных свойств с использованием магнитной левитации
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Описанный метод был разработан на основе принципов магнитной левитации, которая разделяет клетки и частицы на основе их плотности и магнитных свойств. Плотность — это свойство, идентифицирующее тип клетки, напрямую связанное с ее скоростью метаболизма, дифференцировкой и статусом активации. Магнитная левитация позволяет использовать одношаговый подход к успешному разделению, визуализации и характеристике циркулирующих клеток крови, а также к обнаружению анемии, серповидно-клеточной анемии и циркулирующих опухолевых клеток на основе плотности и магнитных свойств. Этот подход также поддается обнаружению растворимых антигенов, присутствующих в растворе, с использованием наборов бусин низкой и высокой плотности, покрытых антителами захвата и обнаружения, соответственно. Если антиген присутствует в растворе, он соединит два набора бусин, создавая новый комплекс бусины-шарик, который будет левитировать между рядами бусин, покрытых антителами. Повышенная концентрация антигена-мишени в растворе будет генерировать большее количество комплексов бисера-шарик по сравнению с более низкими концентрациями антигена, что позволит проводить количественные измерения антигена-мишени. Магнитная левитация выгодна для других методов из-за сокращения времени подготовки образца и отсутствия зависимости от классических методов считывания. Сгенерированное изображение легко захватывается и анализируется с помощью стандартного микроскопа или мобильного устройства, такого как смартфон или планшет.
Введение
Магнитная левитация - это метод, разработанный для разделения, анализа и идентификации типов клеток1,2,3,белков4,5 и опиоидов 6 наоснове исключительно их удельной плотности и парамагнитных свойств. Плотность клетокявляется уникальным, неотъемлемым свойством каждого типа клеток, непосредственно связанным с ее скоростью метаболизма и статусом дифференцировки7,8,9,1....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Экспериментальный протокол, используемый в этом исследовании, был одобрен Институциональным наблюдательным советом Медицинского центра диакониссы Бет Исраэль (IRB).
1. Настройка приборов
ПРИМЕЧАНИЕ: Визуализация левитирующих клеток требует, чтобы два редкоземельных неодимовых магнита, намагниченные на оси Z, были размещены с тем же полюсом, обращенным друг к другу, для создания магнитного поля. Расстояние между магнитами может быть настроено в зависимости от интенсивности магнитного поля и плотности целей. В этом случае магниты разделены пространством 1 мм, достаточным для вставки стеклянной капиллярной трубки длин....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Магнитная левитация фокусирует объекты разной плотности на разных высотах левитации в зависимости от плотности объекта, его магнитной сигнатуры, концентрации парамагнитного раствора и силы магнитного поля, создаваемого двумя сильными редкоземельными магнитами. Поскольку два магнита расположены друг на друге, левитирующие образцы можно просматривать только при сохранении освещения Келера с помощью микроскопа, повернутого на бок(рисунок 1). Конечная высота левитации, достигаемая каждым типом к.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Градиентное центрифугирование в настоящее время является стандартным методом выделения субклеточных компонентов на основе их уникальных плотностей. Этот подход, однако, требует использования специализированных градиентных сред, а также центрифужного оборудования. Представленный здесь подход магнитной левитации позволяет детально иследовать морфологические и функциональные свойства циркулирующих клеток с минимальными, если таковые вообще могут быть, манипуляциями с клетками, обеспечивая почти in vivo доступ к цир.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
У авторов нет конфликтов для раскрытия.
Благодарности
Авторы хотели бы поблагодарить доктора Жетулио Перейру за помощь во внеклеточной работе с везикулами.
Эта работа была поддержана следующими грантами Национального института здравоохранения для МКГ: RO1CA218500, UG3HL147353 и UG3TR002881.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 2-(N-Morpholino)этансульфоновый кислотный гидрат | Sigma Aldrich | M-2933 | (MES); компонент активационного буфера |
| 50x2,5x1 мм магниты, никель (Ni-Cu-Ni) с покрытием, марка N52, намагниченный через 5 мм (0,197") толщиной K | & J Magnetics | Custom | Магниты, используемые для устройства магнитной левитации |
| Герметик капиллярной трубки (Critoseal) | Leica Microsystems | 267620 | Используется для укупорки концов капиллярных трубок |
| Центрифужные трубки фильтры (Corning Costar Spin-X) | Sigma Aldrich | CLS8163 | Используется для промывки шариков |
| Compact Lab Jack | Thorlabs | LJ750 | Используется для регулировки устройства магнитной левитации |
| DPBS, без кальция, без магния | Gibco | 14190-144 | Раствор для суспензий бусин |
| Этаноламин | Sigma Aldrich | E9508-100ML | Используется на этапе стирки для бусин |
| Флуоресцентная плазматическая мембрана Окрашивание (CellMask Green) | Invitrogen | C37608 | Используется для окрашивания резус-факторов |
| Гадотеридол для инъекций | ProHance | NDC 0270-1111-03 | Гадолиний (Gd3+); магнитный раствор, используемый для суспензии клеток |
| HBSS++ | Gibco | 14025-092 | Раствор для подготовки образцов |
| Human C5b,6 complex | Complement Technology, Inc | A122 | Используется для получения RBC Evs |
| Human C7 protein | Complement Technology, Inc | A124 | Используется для получения RBC Evs |
| Human C8 protein | Complement Technology, Inc | A125 | Используется для создания RBC Evs |
| Human C9 protein | Complement Technology, Inc | A126 | Используется для создания RBC Evs |
| Mini Series Post Collar | Thorlabs | MSR2 | Используется для крепления устройства магнитной левитации к лабораторным домкратам |
| N-(3-диметиламинопропил)-N′-этилкарбодиимида гидрохлорида | Sigma Aldrich | E1769-10G | (EDC); используется в реакции связывания антител |
| Normal Rabbit IgG Control | НИР D Systems | AB-105-C | Используется для покрытия бусин в качестве контрольного условия |
| Фосфатный буферный физиологический раствор (10X Раствор, pH 7,4) | Boston Bioproducts | BM-220 | Компонент соединительного буфера, используемый для промывочных этапов |
| Полисорбат 20 (Твин 20) | Sigma Aldrich | P7949-500ML | Компонент буфера активации |
| Полистиролкарбоксилполимер Bangs | Laboratories | PC06004 | Гранулы верхней плотности (1,05 г/мл), используемые для сопряжения антител |
| Rabbit RhD Polyclonal Antibody | Invitrogen | PA5-112694 | Используются для покрытия бусин для детекции резус-фактора в эритроцитах |
| Research Grade Microscope | Olympus | Provis AX-70 | Microscoped используются для крепления устройства магнитной левитации и просмотра левитирующих клеток |
| Резиновые демпфирующие ножки | Thorlabs | RDF1 | Используется для поддержки макетного стола |
| Square Boro Tubing | VitroTubes | 8100-050 | Капиллярная трубка используется для загрузки образца в маглев |
| Sulfo-NHS | Thermoscientific | 24510 | Используется в реакции сопряжения антител |
| Трансляционная стадия | Thorlabs | PT1 | Используется для фокусировки и сканирования капиллярной трубки |
Ссылки
- Tasoglu, S., et al. Levitational Image Cytometry with Temporal Resolution. Advanced Materials. 27 (26), 3901-3908 (2015).
- Durmus, N. G., et al. Magnetic levitation of single cells. Proceedings of the National Academy of Sciences o....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
