Здесь мы вводим процедуру измерения олигомеров белка и агрегации в лисате клеток и живых клетках с использованием флуоресцентной корреляционные спектроскопии.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Обнаружение агрегации белка с помощью спектроскопии корреляции флуоресценции
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Агрегация белка является отличительной чертой нейродегенеративных расстройств, таких как боковой амиотрофический склероз (ALS), болезнь Альцгеймера (AD), болезнь Паркинсона (PD), болезнь Генттона (HD), и так далее. Для обнаружения и анализа растворимых или диффузных белковых олигомеров или агрегатов была использована флуоресцентная корреляционная спектроскопия (FCS), которая может обнаруживать скорость диффузии и яркость одной частицы с одной чувствительностью молекулы. Тем не менее, надлежащая процедура и ноу-хау для обнаружения агрегации белка не получили широкого широкого общего широкогоства. Здесь мы показываем стандартную процедуру измерения FCS для диффузионных свойств склонных к агрегации белков в лизате клетки и живых клетках: ALS-ассоциированный 25 kDa карбоксил-терминальный фрагмент TAR DNA/RNA-связывающего белка 43 kDa (TDP25) и супероксиддисмутазы 1 (SOD1). Репрезентативные результаты показывают, что часть агрегатов зеленого флуоресцентного белка (GFP) с тегами TDP25 была слегка включена в растворимую долю лизата клеток murine neuroblastoma Neuro2a. Кроме того, GFP-тегами SOD1 проведения ALS связанных мутации показывает более медленное распространение в живых клетках. Соответственно, мы здесь вводим процедуру обнаружения агрегации белка с помощью его диффузионные свойства с помощью FCS.
Введение
Белковые агрегации с участием нейродегенеративных расстройств, таких как боковой амиотрофический склероз (ALS), болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, болезнь Хантингтона, итак далее 1, как известно, токсичны и будет нарушать белок гомеостаз (протеостаз) в клетках и органах, которые затем могут привести кстарению 2. Очистка агрегации белка ожидается в качестве терапевтической стратегии; однако химические вещества, предотвращая образование агрегации белка и ухудшая белковые агрегаты (например, небольшие молекулы или наркотики), еще не установлены. Более того, как агрегация белка оказывает токсичность остается неуловимым....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Материалы и реагенты
- Используйте пирогенные свободные растворы и средние для клеточной культуры(таблица 1).
- Подготовка решений для биохимического эксперимента с использованием ультрачистой воды и использовать в качестве DNase / RNase бесплатно.
- Выберите подходящий FBS для клеточной культуры с большим количеством процесса проверки. Поскольку выбранный лот FBS регулярно меняется, каталог и номер лота для FBS не могут быть представлены здесь.
- Плазмидная ДНК
- Подготовка pmeGFP-N15 для выражения мономера eGFP; pmeGFP-C1-TDP256 для выражения GFP-TDP25; pmeGFP-N....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Мы провели измерение FCS GFP-TDP25 в лизаторе клеток и SOD1-G85R-GFP в живых клетках. В обоих случаях удалось приобрести положительную амплитуду и гладкие ACF. Мы показали, что часть GFP-TDP25, выраженная в клетках Neuro2a, была восстановлена в растворимой фракции при указанном состоянии6. В растворимой фракции лизата клетки, чрезвычайно яркие молекулы флуоресценции были обнаружены в записи скорости подсчета фотона с помощью FCS(рисунок 2A, сверху, стрелка). Такие "ши.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Что касается калибровки системы до измерений, то следует использовать те же стеклянные изделия, что и для измерения образца (например, 8-колодцы покрывают стеклянную камеру для ликата клеток и 35-мм стеклянное базовое блюдо для живых клеток). Из-за adorption Rh6G на стекле, его эффективная концентрация иногда может уменьшиться. Если это так, то высококонцентрированный раствор Rh6G, такой как 1 МКМ, следует использовать только для регулировки скважины. Для защиты детектора необходимо избегать чрезвычайно высоких скоростей.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
У этих авторов нет конфликта интересов.
Благодарности
А.К. был поддержан Японского общества содействия науке (JSPS) Грант-в-помощи для научных исследований (C) (#18K06201), грант в помощь от Фонда Накатани по борьбе с новыми коронавирусных инфекций, грант от Университета Хоккайдо Управление по развитию будущих лидеров исследований (L-Station), а также грант в помощь от Hoansha Фонда. М.К. была частично поддержана грантом JSPS по научным исследованиям инновационных областей "Химия для многомолекулярных краудинговых биосистем" (#20H04686) и грантом JSPS по научным исследованиям инновационных областей "Информационная физика живых дел" (#20H05522).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 0,25% (по мас./об.) Трипсин-1 ммоль/л ЭДТА&миддот; Раствор 4Na с феноловым красным (трипсин-ЭДТА) | Fujifilm Wako Pure Chemical Corp. | 201-16945 | |
| 100-мм пластиковая тарелка | CORNING | 430167 | |
| 35-мм стеклянная тарелка | IWAKI | 3910-035 | Для измерения живых клеток |
| 35-мм пластиковая тарелка | Thermo Fisher Scientific | 150460 | |
| Алюминиевая тарелка | Bio-Bik | AB-TC1 | |
| C-Apochromat 40x/1.2NA Korr. UV-VIS-IR M27 | Скребок для объективных | Zeiss | |
| Sumitomo Bakelite Co., Ltd. | MS-93100 | ||
| Фильтрующая мембрана из ацетата целлюлозы (0,22 мм) | Advantech Toyo | 25CS020AS | |
| Крышка стеклянной камеры 8 лунок | IWAKI | 5232-008 | Для измерения |
| раствора модифицированная орлиная среда Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5796 | базальная среда |
| Фетальная бычья сыворотка (FBS) | биосыворотка | Требуется проверка партии | |
| Липофектамин 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
| LSM510 META + ConfoCor3 | Carl Zeiss | система FCS | |
| Мышиная нейробластома Neuro2a клетки | ATCC CCL-131 | Клеточная линия | |
| Opti-MEM I | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| pCAGGS | RIKEN | RDB08938 | Плазмидная ДНК для трансфекционного носителя |
| Раствор пенициллин-стрептомицина (× 100 ) | Fujifilm Wako Pure Chemical Corp. | 168-23191 | |
| pmeGFP-C1-TDP25 | Плазмидная ДНК для TDP25 меченая мономерной eGFP | ||
| pmeGFP-N1 | Плазмидная ДНК для экспрессии мономера eGFP | ||
| pmeGFP-N1-SOD1-G85R | Плазмидная ДНК для ALS-связанного мутанта G85R SOD1, меченного мономерным | ||
| коктейлем ингибиторов протеазы | Sigma-Aldrich | P8304 |
Ссылки
- Ross, C. A., Poirier, M. A. Protein aggregation and neurodegenerative disease. Nature Medicine. 10, Suppl 10-17 (2004).
- Hipp, M. S., Kasturi, P., Hartl, F. U. The proteostasis network and its decline in ageing. Nature Review Molecular Cell Biology. 20 (7), 421-....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
