يظهر هنا إندونوكلياز sgRNA/CAS9 وبروتوكول تسلسل الجيل التالي الذي يمكن استخدامه لتحديد الطفرات المرتبطة بإصلاح كسر الخيط المزدوج بالقرب من مروج CD4.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
استخدام تسلسل الجيل التالي لتحديد الطفرات المرتبطة بإصلاح كسر الخيط المزدوج الناجم عن CAS9 بالقرب من مروج CD4
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
فواصل الخيوط المزدوجة (DSBs) في الحمض النووي هي النوع الأكثر سمية للخلايا من تلف الحمض النووي. نظرا لأن عددا لا يحصى من الإهانات يمكن أن يؤدي إلى هذه الآفات (على سبيل المثال ، إجهاد النسخ المتماثل ، والإشعاع المؤين ، وتلف الأشعة فوق البنفسجية غير المصلحة) ، تحدث DSBs في معظم الخلايا كل يوم. بالإضافة إلى موت الخلايا ، تقلل DSBs التي لم يتم إصلاحها من سلامة الجينوم ويمكن أن تؤدي الطفرات الناتجة إلى تكوين الأورام. هذه المخاطر وانتشار DSBs يحفز التحقيقات في الآليات التي تقوم الخلايا من خلالها بإصلاح هذه الآفات. يمكن إقران تسلسل الجيل التالي بتحريض DSBs عن طريق الإشعاع المؤين لتوفير أداة قوية لتحديد الطفرات المرتبطة بعيوب إصلاح DSB بدقة. ومع ذلك، يتطلب هذا النهج تحديا حسابيا وتكلفة باهظة لتسلسل الجينوم الكامل للكشف عن إصلاح DSBs التي تحدث بشكل عشوائي المرتبطة بالإشعاع المؤين. توفر الإندونوكليز النادرة القطع ، مثل I-Sce1 ، القدرة على توليد DSB واحد ، ولكن يجب إدخال مواقع التعرف عليها في الجينوم محل الاهتمام. ونتيجة لذلك ، فإن موقع الإصلاح مصطنع بطبيعته. تسمح التطورات الحديثة لتوجيه الحمض النووي الريبي (sgRNA) بتوجيه إندونوكليز Cas9 إلى أي موضع جينوم ذي أهمية. يمكن تطبيق ذلك على دراسة إصلاح DSB مما يجعل تسلسل الجيل التالي أكثر فعالية من حيث التكلفة من خلال السماح له بالتركيز على الحمض النووي المحيط ب DSB الناجم عن Cas9. الهدف من المخطوطة هو إثبات جدوى هذا النهج من خلال تقديم بروتوكول يمكنه تحديد الطفرات التي تنبع من إصلاح DSB في المنبع من جين CD4. يمكن تكييف البروتوكول لتحديد التغيرات في الإمكانات الطافرة ل DSB المرتبطة بالعوامل الخارجية ، مثل مثبطات الإصلاح ، والتعبير عن البروتين الفيروسي ، والطفرات ، والتعرض البيئي مع متطلبات حسابية محدودة نسبيا. بمجرد تسلسل جينوم الكائن الحي ، يمكن استخدام هذه الطريقة نظريا في أي موضع جينومي وفي أي نموذج لزراعة الخلايا لهذا الكائن الحي يمكن نقله. ويمكن أن تسمح التعديلات المماثلة للنهج بإجراء مقارنات بين دقة الإصلاح بين مواقع مختلفة في نفس الخلفية الجينية.
المقدمة
الحفاظ على الاستقرار الجينومي أمر بالغ الأهمية لجميع الكائنات الحية. يعد تكرار الحمض النووي الدقيق والاستجابة القوية لتلف الحمض النووي (DDR) ضروريين لنشر المادة الوراثية بأمانة 1,2. تحدث أضرار الحمض النووي بانتظام في معظم الخلايا 2,3. عندما يتم استشعار هذه الأضرار ، يتم إيقاف تقدم دورة الخلية ، ويتم تنشيط آليات إصلاح الحمض النووي. فواصل الخيوط المزدوجة في الحمض النووي أو DSBs هي النوع الأكثر سمية وطفرا من تلف الحمض النووي 3,4.
في حين أن العديد من مسارات إشارات DDR يم....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. طلاء الخلايا
- تنمو خلايا HFK LXSN و HFK 8E6 في ألواح 10 سم في وسائط زراعة الخلايا الكيراتينية (10 مل / لوحة) مع ملحق نمو الخلايا الكيراتينية البشرية (HKGS) و 1٪ البنسلين / الستربتومايسين. تنمو الخلايا إلى حوالي 80٪ من الالتقاء عند 37 درجة مئوية في حاضنة سترة مع 5٪ CO2.
- استبدل وسائط الاستزراع ب 3 مل من التربسين-EDTA (0.05٪ ، حمض الإيثيلين ديامين رباعي أسيتيك). تحضن عند 37 درجة مئوية لمدة 3 دقائق. تحييد التربسين مع حجم متساو من المصل البقري الجنيني (FBS) تكملة الوسائط ونقل الخلايا إلى أنبوب الطرد المركزي 15 مل. جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق.
- أعد تعليق الخلايا التي تحتوي على 10 مل من وسائط زر....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
وتعرض ثلاث نتائج تمثيلية لهذا البروتوكول. الشكل 1 هو لطخة مناعية تؤكد التعبير عن CAS9 في التحكم HFK (LXSN) و HFK الذي يعبر عن بيتا فيروس الورم الحليمي البشري 8E6 (8E6). بعد 48 ساعة من النقل ، تم حصاد محللات الخلايا الكاملة ومن ثم فحصها باستخدام جسم مضاد مضاد CAS9 (أو GAPDH كعنصر تحكم في التحميل). تظهر النتيجة أن HFK LXSN و HFK 8E6 يعبران عن كمية مماثلة من CAS9 مما يشير إلى أن كفاءة النقل متشابهة بين خطين خلويين. الشكل 2 هو صورة م.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
بالإضافة إلى عمق المعلومات المقدمة ، هناك العديد من المزايا لهذه الطريقة. أولا ، يمكن تقييم إصلاح DSB ، من الناحية النظرية ، في أي موقع جينومي دون تعديل جينوم الخلية محل الاهتمام. ثانيا ، يتم زيادة الوصول إلى تحليل NGS للإصلاح من خلال انخفاض التكلفة والجهد الحسابي الذي يوفره إنشاء وتحليل DSB واحد يستهدف منطقة محددة. وأخيرا، مع توفر جينومات الكائنات الحية الإضافية بشكل روتيني والمنشورات المتعددة التي تظهر بنجاح نقل خطوط الخلايا الثديية وغير الثديية المتنوعة، من المتوقع أن تكون فائدة هذا النهج واسعة النطاق
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
تم دعم الأبحاث الواردة في هذه المخطوطة من قبل المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة التابع للمعاهد الوطنية للصحة (P20GM130448) (NAW و RP) ؛ المعهد الوطني للسرطان التابع للمعاهد الوطنية للصحة (NCI R15 CA242057 01A1) ؛ مركز جونسون لأبحاث السرطان في جامعة ولاية كانساس. ووزارة الدفاع الأمريكية (CMDRP PRCRP CA160224 (NAW)). نحن نقدر KSU-CVM Confocal Core و Joel Sanneman للفحص المجهري المناعي لدينا. المحتوى هو مسؤولية المؤلفين وحدهم ولا يمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية لوكالات التمويل هذه.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 6 لوحة ثقافة أنسجة الآبار | Celltreat | 229106 | لوحة ثقافة الخلية |
| BCA Kit | VWR | 89167-794 | مجموعة فحص BCA |
| طرد مركزي 5910 R | Eppendorf | 2231000772 | أجهزة الطرد المركزي المنضدية |
| CLC منضدة العمل الجينومية | Qiagen | 832001 | برنامج تحليل بيانات التسلسل العميق / المتصل indel / المتصل المتغير |
| Digital Microplate Genie نبض | الصناعات العلمية | SI-400A | لوحة شاكر |
| DYKDDDDK العلامة الجسم المضاد أحادي النسيلة (FG4R) | ThermoFisher Scientific | MA191878 | الأجسام المضادة المضادة |
| FLAG Epilife CF Kit | ThermoFisher Scientific | MEPICF500 | Cell cultrue Media والمكملات |
| الغذائية مصل الأبقار الجنيني (FBS) | VWR | 89510-194 | مكمل زراعة الخلايا |
| الماعز المضاد للأرانب IgG | ThermoFisher Scientific | A-11012 | نظام تنظيف الأجسام المضادة الثانوية |
| HighPrep PCR | MagBio | AC-60005 | طقم تنظيف PCR القائم على الخرز |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix PCR Kit | KAPA Biosystems | KK2600 | PCR mastermix / PCR assay |
| MagAttract HMW DNA kit | Qiagen | 67563 | طقم استخراج الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي |
| حامل مغناطيسي -96 | Thermo Fisher Scientific | AM10027 | 96 بئر الرف المغناطيسي |
| MiniAmp Thermal Cycler | Applied Biosystems | A37834 | Thermal Cycler |
| Miseq | Illumina | SY-410-1003 | Sequencer |
| Miseq v2 300 دورة كاشف كيت | Illumina | MS-102-2002 | 300 دورة خرطوشة / كواشف التسلسل |
| Nextera XT DNA Library مجموعة الإعدادية | Illumina | FC-131-1024 | طقم تحضير المكتبة |
| Nextera XT Kit v2 مجموعة | Illumina | 20027215 | Indexes |
| Nunc 96 جيدا من مادة البولي بروبيلين DeepWell Stroage | Plates Thermo Fisher Scientific | 260251 | بئر عميق 96 بئر محلول |
| البنسلين الستربتومايسين (100X) | Calsson Labs | PSL02-6X100ML | المضادات الحيوية لزراعة الخلايا |
| محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) | Bio Basic | PD8117 | PBS |
| px330-CD4 | Addgen | 136938 | بلازميدات SgRNA / CAS9 التي تستهدف 5 '- GGCGTATCTGTGTGAGGACT |
| QIAxcel النظام المتقدم | Qiagen | 9001941 | آلة الرحلان الكهربائي الشعرية |
| QIAxcel مجموعة فحص الحمض النووي | Qiagen | 929004 | عازلة الحمض النووي / أنابيب الكهربية الشعرية Qubit |
| 1x ds HS Assay Kit | ThermoFisher Scientific | Q23851 | كواشف مقياس الفلور / 1x حل dsDNA |
| Qubit 4 مقياس الفلور | ThermoFisher Scientific | Q33238 | أنبوب |
| الفلور | Thermo Fisher Scientific | Q32856 | أنابيب فحص مقياس الفلور |
| RIPA Lysis Buffer | VWR | VWRVN653-100ML | عازلة التحلل لاستخراج |
| البروتين Trypsin-EDTA (0.05٪) ، أحمر | الفينولThermoFisher Scientific | 25300054 | Trypsin |
| Vortex-Genie 2 | الصناعات العلمية | SI-0236 | كاشف الدوامة |
| Xfect كاشف الإرسال | Takara Bio | 631318 | كاشف Transfection |
| برنامج تحليل البيانات الجينومية | QIAGEN | CLC Workbench v21.0. | برنامج تحليل البيانات |
المراجع
- Vítor, A. C., Huertas, P., Legube, G., de Almeida, S. F. Studying DNA double-strand break repair: an ever-growing toolbox. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, (2020).
- Giglia-Mari, G., Zotter, A., Vermeulen, W. DNA damage response. Cold Spring Harbor Perspectives in Bio....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
