利用下一代测序技术鉴定与Cas9诱导的CD4启动子附近双链断裂修复相关的突变

摘要

本文介绍了一种sgRNA/CAS9核酸酶与下一代测序的实验方案，可用于鉴定与CD4启动子附近双链断裂修复相关的突变。

摘要

DNA中的双链断裂（DSBs）是最具细胞毒性的DNA损伤类型。由于多种损伤因素均可导致此类病变（例如复制应激、电离辐射、未修复的紫外线损伤），大多数细胞每天都会发生DSBs。除了引起细胞死亡外，未修复的DSBs还会降低基因组完整性，由此产生的突变可能促进肿瘤发生。这些风险以及DSBs的普遍性促使人们深入研究细胞修复这些损伤的机制。新一代测序技术可与电离辐射诱导的DSBs相结合，成为精确定义与DSB修复缺陷相关突变的有力工具。然而，该方法需要进行计算复杂且成本高昂的全基因组测序，以检测电离辐射所引发的随机分布的DSBs的修复情况。稀有切割内切酶（如I-SceI）能够产生单一的DSB，但其识别位点必须预先插入目标基因组中，因此修复位点本质上是人为构建的。近期的技术进展使得单导向RNA（sgRNA）可将Cas9内切酶靶向至任意感兴趣的基因组位点。这一技术可用于DSB修复的研究，通过将新一代测序聚焦于Cas9诱导的DSB侧翼区域，从而显著降低测序成本。本文的目标是通过展示一种可定义CD4基因上游DSB修复所引发突变的实验方案，验证该方法的可行性。该方案可被改造用于评估外源因素（如修复抑制剂、病毒蛋白表达、突变及环境暴露）对DSB诱变潜能的影响，且计算资源需求相对有限。一旦某生物体的基因组完成测序，该方法理论上可应用于该生物体任何可转染的细胞培养模型中的任意基因组位点。对该方法进行类似改造还可实现相同遗传背景下不同基因座之间修复保真度的比较。

引言

维持基因组稳定性对所有生物体都至关重要。准确的DNA复制和强大的DNA损伤应答（DDR）是遗传物质忠实传递所必需的^1,2。在大多数细胞中，DNA损伤会频繁发生^2,3。当这些损伤被识别后，细胞周期进程将被阻滞，同时激活DNA修复机制。DNA中的双链断裂（DSB）是最具毒性且最易引发突变的DNA损伤类型^3,4。

尽管存在多种DNA损伤应答（DDR）信号通路可修复这些损伤，但研究最为深入的双链断裂（DSB）修复通路是同源重组（HR）和非同源末端连接（NHEJ）。HR是一种基本无错误的修复途径，利用姐妹染色单体作为同源模板来修复DSB，通常发生在细胞周期的S期和G2期^5,6,7。NHEJ则更容易出错，但可在整个细胞周期中发生^8,9。目前....

方案

1. 细胞铺板

1. 在10 cm培养皿中，使用角质形成细胞培养基（每皿10 mL），添加人角质形成细胞生长添加剂（HKGS）和1%青霉素/链霉素，培养HFK LXSN和HFK 8E6细胞。将细胞在37 °C、5% CO₂的加温培养箱中培养至约80%汇合度。
2. 用3 mL胰蛋白酶-EDTA（0.05%，乙二胺四乙酸）替换培养基。在37 °C孵育3分钟。用等体积含胎牛血清（FBS）的补充培养基中和胰蛋白酶，将细胞转移至15 mL离心管中。以300 x g离心5分钟。
3. 用10 mL含HKGS的角质形成细胞培养基重悬细胞。使用血细胞计数板测定细胞浓度。
4. 在6 cm培养皿中接种4 × 10⁵个细胞/皿（HFK LXSN接种两皿，HFK 8E6接种两皿），每皿加入4 mL含HKGS以及1%青霉素和链霉素的角质形成细胞培养基。在37 °C、5% CO₂的加温培养箱中培养。
   注意：本实验方案选择HFK细胞进行分析基于两个原因。首先，HFK是一种转染难度较高的细胞系。因此，若本方案在该细胞系中有效，则表明其在更常用且更易转染的细胞中也可能有效。其次，已有发表数据表明，一种病毒蛋白（8E6）会阻碍DNA双链断裂的修复^20,21

结果

本方案展示了三个代表性实验结果。图1为免疫印迹结果，证实了CAS9在HFK对照细胞（LXSN）及表达β-人乳头瘤病毒8E6（8E6）的HFK细胞中的表达情况。转染48小时后，收集全细胞裂解液，并使用抗CAS9抗体（或以GAPDH作为上样对照）进行检测。结果显示，HFK LXSN与HFK 8E6细胞中CAS9的表达量相似，表明两种细胞系的转染效率相当。图2为免疫荧光显微镜图像，通过pH2AX焦点（DSB的经典标志物²⁴）显示CAS9诱导的DNA双链断裂（DSB）。该结果表明，CAS9/sgRNA成功诱导了两个DSB，证实DSB的产生符合预期。图3显示，8E6可增加CAS9诱导的DSB位点周围200 Kb范围内的基因组变异²²。该发现与HPV8 E6蛋白扰乱DSB修复并加剧基因组不稳定性这一假说一致。本图.......

讨论

除了所提供的信息深度之外，该方法还具有多个优势。首先，理论上，无需对目标细胞的基因组进行修饰，即可在任何基因组位点评估双链断裂（DSB）修复。其次，由于仅需在特定区域诱导并分析单个靶向的DSB，从而降低了测序成本和计算分析的复杂性，使得高通量测序（NGS）对修复过程的分析更加便捷。最后，随着越来越多物种的基因组被陆续解析，以及多项研究已成功实现多种哺乳类和非哺乳类细胞系的转染，预计该方法的应用范围将十分广泛^10,23,24。

本研究以人包皮角质形成细胞中的DNA双链断裂（DSB）修复作为示例进行分析。角质形成细胞的转染效率通常低于其他组织类型。因此，本实验方案采用了一种针对这类难转染细胞优化的转染方法。应根据所研究的细胞类型对转染方法进行相应优化。本方案中使用的CAS9诱导DSB的能力已在骨肉瘤、结肠癌、肺癌、成纤维细胞、胚胎肾细胞及人角质形成细胞中得到验证^10.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
6 孔组织培养板	Celltreat	229106	细胞培养板
BCA 试剂盒	VWR	89167-794	BCA 检测试剂盒
Centrifuge 5910 R	Eppendorf	2231000772	台式离心机
CLC Genomic Workbench	Qiagen	832001	深度测序数据分析软件/插入缺失检测工具/变异检测工具
Digital Microplate Genie pulse	Scientific industries	SI-400A	微孔板振荡器
DYKDDDDK Tag Monoclonal Antibody (FG4R)	ThermoFisher Scientific	MA191878	抗 FLAG 抗体
Epilife CF 试剂盒	ThermoFisher Scientific	MEPICF500	细胞培养基及添加剂
胎牛血清（FBS）	VWR	89510-194	细胞培养添加剂
山羊抗兔 IgG	ThermoFisher Scientific	A-11012	二抗
HighPrep PCR Clean-up 系统	MagBio	AC-60005	基于磁珠的 PCR 纯化试剂盒
KAPA HiFi HotStart ReadyMix PCR 试剂盒	KAPA Biosystems	KK2600	PCR 预混液/PCR 检测试剂
MagAttract HMW DNA 试剂盒	Qiagen	67563	高分子量 DNA 提取试剂盒
96 孔磁力架	Thermo Fisher Scientific	AM10027	96 孔磁力架
MiniAmp 温控循环仪	Applied Biosystems	A37834	温控循环仪
Miseq	Illumina	SY-410-1003	测序仪
Miseq v2 300 循环试剂盒	Illumina	MS-102-2002	300 循环测序 cartridge/测序试剂
Nextera XT DNA 文库制备试剂盒	Illumina	FC-131-1024	文库制备试剂盒
Nextera XT 试剂盒 v2 A 组	Illumina	20027215	Index 引物组
Nunc 96 孔聚丙烯深孔储存板	Thermo Fisher Scientific	260251	96 孔深孔板
青霉素-链霉素溶液（100X）	Calsson Labs	PSL02-6X100ML	细胞培养用抗生素
磷酸盐缓冲液（PBS）	Bio Basic	PD8117	PBS
px330-CD4	Addgen	136938	靶向 5’- GGCGTATCTGTGTGAGGACT 的 sgRNA/CAS9 质粒
QIAxcel Advanced 系统	Qiagen	9001941	毛细管电泳仪
QIAxcel DNA 筛查试剂盒	Qiagen	929004	DNA 缓冲液/毛细管电泳管
Qubit 1x ds HS 检测试剂盒	ThermoFisher Scientific	Q23851	荧光计试剂/1x dsDNA 溶液
Qubit 4 荧光计	ThermoFisher Scientific	Q33238	荧光计
Qubit 检测管	Thermo Fisher Scientific	Q32856	荧光计检测管
RIPA 裂解缓冲液	VWR	VWRVN653-100ML	蛋白提取用裂解缓冲液
胰蛋白酶-EDTA（0.05%），含酚红	ThermoFisher Scientific	25300054	胰蛋白酶
Vortex-Genie 2	Scientific industries	SI-0236	涡旋振荡器
Xfect 转染试剂	Takara Bio	631318	转染试剂
基因组数据分析软件	QIAGEN	CLC Workbench v21.0.	数据分析软件