Utilizzo del sequenziamento di nuova generazione per identificare le mutazioni associate alla riparazione di una rottura a doppio filamento indotta da CAS9 vicino al promotore CD4

Sommario

Qui viene presentata l'endonucleasi sgRNA/CAS9 e il protocollo di sequenziamento di nuova generazione che può essere utilizzato per identificare le mutazioni associate alla riparazione della rottura del doppio filamento vicino al promotore CD4.

Abstract

Le rotture a doppio filamento (DSB) nel DNA sono il tipo più citotossico di danno al DNA. Poiché una miriade di insulti può causare queste lesioni (ad esempio, stress di replicazione, radiazioni ionizzanti, danni UV non riparati), i DSB si verificano nella maggior parte delle cellule ogni giorno. Oltre alla morte cellulare, i DSB non riparati riducono l'integrità del genoma e le mutazioni risultanti possono guidare la tumorigenesi. Questi rischi e la prevalenza di DSB motivano le indagini sui meccanismi con cui le cellule riparano queste lesioni. Il sequenziamento di nuova generazione può essere abbinato all'induzione di DSB mediante radiazioni ionizzanti per fornire un potente strumento per definire con precisione le mutazioni associate ai difetti di riparazione del DSB. Tuttavia, questo approccio richiede un sequenziamento dell'intero genoma computazionalmente impegnativo e proibitivo per rilevare la riparazione dei DSB che si verificano casualmente associati alle radiazioni ionizzanti. Rare endonucleasi da taglio, come I-Sce1, forniscono la capacità di generare un singolo DSB, ma i loro siti di riconoscimento devono essere inseriti nel genoma di interesse. Di conseguenza, il sito di riparazione è intrinsecamente artificiale. Recenti progressi consentono all'RNA guida (sgRNA) di dirigere un'endonucleasi Cas9 a qualsiasi locus del genoma di interesse. Questo potrebbe essere applicato allo studio della riparazione del DSB rendendo il sequenziamento di prossima generazione più conveniente consentendo di concentrarsi sul DNA che fiancheggia il DSB indotto da Cas9. L'obiettivo del manoscritto è dimostrare la fattibilità di questo approccio presentando un protocollo in grado di definire mutazioni che derivano dalla riparazione di un DSB a monte del gene CD4. Il protocollo può essere adattato per determinare i cambiamenti nel potenziale mutageno del DSB associati a fattori esogeni, come inibitori di riparazione, espressione proteica virale, mutazioni ed esposizioni ambientali con requisiti di calcolo relativamente limitati. Una volta che il genoma di un organismo è stato sequenziato, questo metodo può essere teoricamente impiegato in qualsiasi locus genomico e in qualsiasi modello di coltura cellulare di quell'organismo che può essere trasfettato. Adattamenti simili dell'approccio potrebbero consentire confronti di fedeltà di riparazione tra diversi loci nello stesso background genetico.

Introduzione

Mantenere la stabilità genomica è fondamentale per tutti gli organismi viventi. Una replicazione accurata del DNA e una robusta risposta al danno del DNA (DDR) sono necessarie per propagare fedelmente il materiale genetico ^1,2. I danni al DNA si verificano regolarmente nella maggior parte delle cellule ^2,3. Quando questi danni vengono rilevati, la progressione del ciclo cellulare viene interrotta e vengono attivati i meccanismi di riparazione del DNA. Le rotture a doppio filamento nel DNA o nei DSB sono il tipo più tossico e mutageno di danno al DNA

Protocollo

1. Placcatura cellulare

1. Coltiva cellule HFK LXSN e HFK 8E6 in piastre da 10 cm in terreni di coltura di cheratinociti (10 ml / piastra) con integratore di crescita dei cheratinociti umani (HKGS) e 1% di penicillina / streptomicina. Far crescere le cellule a circa l'80% di confluenza a 37 °C in un incubatore a camicia con il 5% di CO₂.
2. Sostituire i terreni di coltura con 3 ml di tripsina-EDTA (0,05%, acido tetraacetico etilendiammina). Incubare a 37 °C per 3 min. Neutralizzare la tripsina con uguale volume di siero bovino fetale (FBS) integrato nei mezzi e trasferire le cellule in un tubo centrifugo da 15 ml. Centrifuga a....

Risultati

Per questo protocollo vengono presentati tre risultati rappresentativi. La Figura 1 è un immunoblot che conferma l'espressione di CAS9 nel controllo HFK (LXSN) e HFK che esprime beta-HPV 8E6 (8E6). 48 ore dopo la trasfezione, i lisati a cellule intere sono stati raccolti e successivamente sondati con un anticorpo anti-CAS9 (o GAPDH come controllo del carico). Il risultato mostra che HFK LXSN e HFK 8E6 esprimono una quantità simile di CAS9, indicando che l'eff.......

Discussione

Oltre alla profondità delle informazioni fornite, ci sono diversi vantaggi in questo metodo. In primo luogo, la riparazione DSB, in teoria, può essere valutata in qualsiasi loci genomico senza modificare il genoma della cellula di interesse. In secondo luogo, l'accesso all'analisi NGS della riparazione è aumentato dal costo ridotto e dallo sforzo computazionale offerto dalla creazione e dall'analisi di un singolo DSB mirato a un'area definita. Infine, con i genomi di altri organismi che diventano regolarmente disponibili.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Piastra per coltura tissutale a 6 pozzetti	Celltreat	229106	Piastra per coltura cellulare
Kit BCA	VWR	89167-794	Kit di analisi BCA
Centrifuga 5910 R	Eppendorf	2231000772	Centrifuga da tavolo
CLC Banco di lavoro genomico	Qiagen	832001	Software di analisi dei dati a sequenza profonda/chiamante indel/chiamante di variante
Digital Microplate Genie pulse	Scientific industries	SI-400A	Agitatore per piastre
DYKDDDDK Tag Anticorpo monoclonale (FG4R)	ThermoFisher Scientific	MA191878	Anticorpo anti-FLAG
Kit Epilife CF ThermoFisher	Scientific	MEPICF500	Terreni e integratori per colture cellulari
Siero fetale bovino (FBS)	VWR	89510-194	Integratore per colture cellulari
IgG anti-coniglio di capra	ThermoFisher Scientific	A-11012	Anticorpo secondario
HighPrep PCR Clean-up System	MagBio	AC-60005	Kit di pulizia PCR basato su perline
KAPA HiFi HotStart ReadyMix PCR Kit	KAPA Biosystems	KK2600	PCR mastermix/PCR assay
MagAttract HMW DNA kit	Qiagen	67563	Kit di estrazione del DNA ad alto peso molecolare
Magnetic Stand-96	Thermo Fisher Scientific AM10027		rack magnetico a 96 pozzetti
	Applied Biosystems	A37834	Termociclatore
Miseq	Illumina	SY-410-1003	Sequenziatore
Miseq v2 Kit di reagenti a 300 cicli	Illumina	MS-102-2002	Reagenti a cartuccia/sequenziamento a 300 cicli
Nextera XT Kit di preparazione della libreria DNA	Illumina	FC-131-1024	Kit di preparazione della libreria
Nextera XT Kit v2 Set A	Illumina	20027215	Indici
Nunc Piastre DeepWell Stroage in polipropilene a 96 pozzetti	Thermo Fisher Scientific	260251	piastre a 96 pozzetti
di penicillina-streptomicina (100X)	Calsson Labs	PSL02-6X100ML	Antibiotici per colture cellulari
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)	Bio Basic	PD8117	PBS
px330-CD4	Addgen	136938	plasmidi SgRNA/CAS9 che hanno come bersaglio 5'- GGCGTATCTGTGTGAGGACT
QIAxcel Advanced System	Qiagen	9001941	macchina per elettrofesi capillare
QIAxcel Kit di screening del DNA Qiagen		929004	tampone DNA / provette per elettrofesi capillare
Qubit 1x ds HS Assay	Kit ThermoFisher Scientific	Q23851	Reagenti fluorimetrici/1x soluzione dsDNA
Qubit 4 Fluorimetro	ThermoFisher Scientific	Q33238	Fluorimetro
Qubit Provette per saggi	Thermo Fisher Scientific	Q32856	Provette per saggi fluorimetrico
RIPA Tampone di lisi	VWR	VWRVN653-100ML	Tampone di lisi per l'estrazione di proteine
Tripsina-EDTA (0,05%), rosso	fenoloThermoFisher Scientific	25300054	Trypsin
Vortex-Genie 2	Scientific industries	SI-0236	Reagente di
trasfezione Vortex Xfect	Takara Bio	631318	Reagente di trasfezione
Software di analisi dei dati genomici	QIAGEN	CLC Workbench v21.0.	Software di analisi dati

Termociclatore MiniAmp con Soluzione