Summary
הפרוטוקולים שדווחו כאן ממחישים שלוש דרכים חלופיות להעריך את הביצועים של יתושים מהונדסים גנטית המיועדים לבקרה וקטורית בניסויי כלוב קטנים הכלולים במעבדה. כל פרוטוקול מותאם לשינוי הספציפי שדובי זן היתושים (כונן גנים או כונן שאינו גנים) וסוגי הפרמטרים הנמדדים.
Abstract
שליטה על פתוגנים המועברים על ידי יתושים באמצעות וקטורים מהונדסים גנטית הוצעה ככלי מבטיח להשלמת אסטרטגיות בקרה קונבנציונליות. מערכות הנעת גנים ביות מבוססות CRISPR הפכו טכנולוגיות מהונדסות לנגישות יותר בקהילה המדעית. הערכה של ביצועי יתושים מהונדסים והשוואות עם עמיתים מסוג בר בניסויי כלוב מעבדה קטנים מספקים נתונים חשובים לתכנון ניסויים הבאים בכלוב שדה והערכות ניסיוניות כדי לחדד את האסטרטגיות למניעת מחלות. כאן, אנו מציגים שלושה פרוטוקולים שונים המשמשים בהגדרות מעבדה להערכת התפשטות טרנסג'ן בווקטורים יתושים אנופלינים של מלריה. אלה כוללים מהדורות מוצפות (ללא מערכת כונן גנים), וניסויי דור חופפים ולא חופפים של כונן גנים. שלושת הניסויים משתנים במספר פרמטרים וניתן להתאיםם להגדרות הניסוי הרצויות. יתר על כן, מחקרי חרקים בכלובים קטנים הם חלק מהמעבר המתקדם של חרקים מהונדסים מהמעבדה לשחרורי שטח פתוחים. לכן, הפרוטוקולים המתוארים כאן מייצגים כלים יקרי ערך כדי לספק ערכים אמפיריים שבסופו של דבר יסייעו ביישום שדה של טכנולוגיות חדשות לחיסול מלריה.
Introduction
אסטרטגיות המבוססות על יתושים מהונדסים גנטית נרדפות כדי לשלוט בהעברת פתוגנים וקטוריים כמו אלה הגורמים למלריה1. אלה כוללים טכנולוגיות 1) שמטרתן להקטין את המספרים והצפיפות של יתושי אנופלס (דיכוי אוכלוסיה), או 2) שמטרתם לפגוע ביכולתם של וקטורים להעביר טפילים האחראים למחלות אנושיות (שינוי אוכלוסין, החלפה או שינוי) שבה זנים של וקטורים מתוכננים לבטא גנים משפיעים המונעים העברת פתוגן. גישות גנטיות אלה התחזקו על ידי הופעתם של כונני גנים מבוססי CRISPR/Cas9, עם הוכחות מושג יתושים מעבירי טפילים של התפשטות יעילה של תכונות מטען, כמו גם מולקולות אפקט אנטי טפיל באוכלוסיות בכלוב.
ניסויי כלוב מעבדה קטנים מייצגים צעד ראשון להערכת המאפיין של זנים מהונדסים כחלק מגישה בשלבים להתפתחותם הנוספת לקראת יישומי שדה2. שיקולי תוצאה ספציפיים כוללים תורשתיות של ה- DNA שהוצג בסביבה תחרותית, חהירות והבעה של הפנוטיפ, ויציבות. תכונות העיצוב הניסיוניות הרלוונטיות כוללות את גודל הכלובים, צפיפות היתושים, מספר השכפולים, דורות חופפים או לא חופפים, אוכלוסיות יעד בנויות גיל, שחרורים בודדים או מרובים של זנים מהונדסים, שחרורים לגברים בלבד, לנשים בלבד או למין מעורב, יחסי שחרור, מקורות לארוחות דם (בעלי חיים מלאכותיים או חיים) והליכי סינון.
אנו מתארים כאן פרוטוקולים המשמשים להערכת זנים של יתושים אנופלינים עבור שחרורים מוצפים (ללא מערכת כונן גנים) ואלה הנושאים מערכות הנעת גנים אוטונומיות בתיווך Cas9 אנדונוקלאזים ומנחים RNAs (gRNA). יישומים של פרוטוקולים אלה מופיעים ב- Pham et al. (2019) 2, קרבלאר-ליירזו ואח'. (2020) 3, ואדולפי ואח'. (2020) 4.
ניסויי שחרור מוצפים מעריכים את קצב ההתפשטות של טרנסג'נדר מעוצב תחת ירושה מנדליאנית בעקבות שחרורים מרובים של מספר רב של יתושים מהונדסים לאוכלוסיית בר. ללא צירוף הטרנסג'ן למערכת כונן, נתונים מניסויי שחרור מוצפים מספקים מידע לגבי הכושר והדינמיקה של טרנסג'ן של עניין באוכלוסייה מיוצבת.
כאשר אוכלוסיות יתושים מכילות מערכת הנעת גנים אוטונומית, ניסויי כלוב קטנים נועדו להעריך את הדינמיקה של התפשטות הטרנסג'ן הרצוי על ידי קביעת קצב עליית הסמן הדומיננטי בעקבות הקדמה אחת של זכרים מהונדסים. אלמנטים אוטונומיים של הנעת גנים נושאים את הגנים המקדדים את גרעין Cas9, ה- gRNA והסמן הדומיננטי המקושרים באופן כזה להיות פעילים בדורות הבאים.
דורות 'חופפים' מתייחסים לנוכחות סימולטנית של דורות רבים באותו כלוב כדי ליצור אוכלוסייה רציפה הבנויה גיל, בעוד ש'לא חופפים' מתייחס לדורות נפרדים בודדים בכל אוכלוסייה בכלוב רצופה2. ניתן להפסיק ניסויי כלוב בהנעת גנים לאחר שניתן לקבוע את הדינמיקה הראשונית של שיעור הכונן (המרה) (8-10 דורות בהתאם למבנה), ובעוד שהם מספקים מידע על היציבות לטווח הקצר של הטרנסג'ן באוכלוסיית היתושים, הם עשויים שלא לחשוף מה קורה כאשר ואם תדרי הסמן הדומיננטיים מגיעים או קרובים להקדמה מלאה (כל יתוש הנושא לפחות עותק אחד של מערכת הנעת הגנים).
Protocol
הצהרת אתיקה של בעלי חיים
מחקר זה נערך בהתאם להמלצות במדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה של המכונים הלאומיים לבריאות. הפרוטוקולים אושרו על ידי הוועדות המוסדיות לטיפול בבעלי חיים ושימוש באוניברסיטת קליפורניה (מספרי הבטחת רווחת בעלי חיים A3416.01).
1. ניסויי שחרור מוצפים על יתושים שאינם גנים (איור 1)
- התקנה ותחזוקה של כלוב
- הגדר שלושה סטים של כלובים משולשים בגודל 0.216 מ"ק על-ידי הוספת 60 זחלי בר מסוג שני (WT) בכל כלוב במשך שלושה שבועות רצופים.
הערה: לא ניתן לקבוע את המין של זחלים השני-instar על ידי מיקרוסקופיה קלה, ולכן הדגימות שנוספו לכל כלוב יורכבו הן זכרים והן נקבות. - בכל שבוע, ספקו לנקבות בוגרות בכל כלוב עכברים מרדים כמקור דם (איור 2A) ומיכל ערך 3 ימים לאחר נקזת הדם.
הערה: בעוד שניתן להשתמש במנגנון האכלה מלאכותי חלופי, מתן עכברים חיים מרדים עבור קמתות דם גורם לביצועי האכלה טובים יותר של יתושים בפורמטים גדולים אלה (0.216 מ"ק) של כלוב. זה דורש פרוטוקול מאושר לשימוש בבעלי חיים ורלוונטי (למשל, מוסדית טיפול ושימוש הוועדה, IACUC) אישור לשימוש בעכברים.
הערה: עכברים בודדים הם מרדים עם תערובת של 4 מ"ג / עכבר קטמין HCl ו 0.4 מ"ג / עכבר קסילאצין. בעלי חיים מוזרקים עם בין 0.1 - 0.5 מ"ל של תערובת זו. - ביצי צוהר מכל כלוב מדי שבוע ובחרו 60 זחלים שניים (L2) באקראי שיוחזרו לכלובים שלהם כדי לקזז את התמותה (שבועות 4-8).
הערה: שלבים 1.1.1 עד 1.1.3 נחוצים כדי להקים אוכלוסייה יציבה ומופצת הבנויה בגיל בכלובים - המכונה 'שלב ראשוני'. - בשבוע 9, להקצות כלובים התאספו בשלב 1.1.1 באופן אקראי משולש לשחרורים של יחס השחרור הגברי הרצוי.
- ייעד קבוצה אחת של כלובים משולשים כפקדים להערכת עקביות לאורך כל הניסוי.
- ייעד קבוצה אחת של טריפליקאטים עבור כל יחס שחרור רצוי (לדוגמה, 1:1 או 1:0.1 מהונדס:זכרי WT).
הערה: נקודה זו מופעלת מכונה 'שלב ניסיוני'.
- הגדר שלושה סטים של כלובים משולשים בגודל 0.216 מ"ק על-ידי הוספת 60 זחלי בר מסוג שני (WT) בכל כלוב במשך שלושה שבועות רצופים.
- שכפול ויחסי שחרור
- הוסף 60 גלמים WT (30 זכרים ו -30 נקבות) לכלובי הבקרה בכל שבוע.
- כדי לשמור על יחס של 1:1, הוסיפו 30 גלמים זכרים מהונדסים שבועיים יחד עם 60 (30 גברים ו-30 נקבות) גלמים WT לכל כלוב בהתאמה.
- כדי לשמור על יחס של 1:0.1, הוסיפו 300 גלמים זכרים מהונדסים שבועיים יחד עם 60 (30 גברים ו-30 נקבות) גלמים WT לכל כלוב בהתאמה.
הערה: תוספת מתמשכת של יתושי בר לכלובים שומרת על צפיפות הכלובים, אשר צפויה להצטמצם כל שבוע בשל תמותת מבוגרים הקשורה לגיל.
- הקרנת פנוטיפים
- בחר בסך הכל 300 זחלים מכל כלוב באקראי. בעזרת מיקרוסקופ סטריאו המצויד במסנני פלואורסצנטיות, מסך לביטוי הסמן הדומיננטי הפלואורסצנטי בשלבי הזחל והפופלים והציון למינם של המבוגרים המתקבלים (איור 3).
הערה: ההקרנה הפנוטיפית תהיה תלויה בסמן הדומיננטי הכלול במבנה הטרנסג'ן המשולב יתושים (לדוגמה, דיסקוסומה sp. חלבון פלואורסצנטי אדום [DsRed], חלבון פלואורסצנטי ציאן [CFP], חלבון פלואורסצנטי ירוק [GFP]), ועל האמרגן המניע את הביטוי שלו (הנפוץ ביותר בטרנסגנזה יתושים הוא ביטוי הנהיגה של מקדם 3xP3 בעיניים ובחבל העצב). - פעל לפי פרוטוקול זה במשך דורות רבים ככל שנדרש על ידי פרמטרי התוצאה המוגדרים בתכנון הניסויי.
הערה: הניסוי מסתיים בדרך כלל כאשר לכל היתושים יש לפחות עותק אחד של הטרנסג'ן (שנקבע על ידי נוכחותו של הסמן הפלואורסצנטי הדומיננטי) או שהיחס בין יתושים מהונדסים ל- WT בכלוב מיוצב ואינו משתנה מאוד לאחר כמה דורות (3-5).
- בחר בסך הכל 300 זחלים מכל כלוב באקראי. בעזרת מיקרוסקופ סטריאו המצויד במסנני פלואורסצנטיות, מסך לביטוי הסמן הדומיננטי הפלואורסצנטי בשלבי הזחל והפופלים והציון למינם של המבוגרים המתקבלים (איור 3).
2. ניסויי דור חופפים של יתושים המונעים על ידי גנים (איור 4)
הערה: יתושים הנושאים מערכות כונן גנים דורשים פרוטוקולים כתובים ונבדקים ויש לאשרם על ידי ועדת בטיחות ביולוגית מוסדית (IBC) או שווה ערך, ואחרים במידת הצורך. בלימת יתושים (רמת ACL 2+ ) צריכה לפעול על פי הנהלים המומלצים5,6,7. באופן ספציפי, ניסויי הנעת הגנים צריכים להשתמש בשתי אסטרטגיות כליאה מחמירות. הראשון הוא בדרך כלל מחסומים פיזיים (אסטרטגיית מחסום) בין אורגניזמים לסביבה. זה דורש נהלי הפעלה מאובטחים ותקן (כולל ניטור) כדי להבטיח כי יתושים לא יכולים לברוח. אסטרטגיית הכליאה השנייה יכולה להיות מולקולרית, אקולוגית או רבייה5.
- הגדרת כלוב
- הגדר שני סטים של כלובים משולשים 0.216 מ"ק עבור כל יחס שחרור גברי הרצוי: WT זכר.
- כדי להשיג יחס שחרור גברי של 1:1, הוסף 120 זכרים מהונדסים, 120 זכרי WT ו -120 נקבות WT בשלב הגולם לכל כלוב לשכפל.
- כדי להשיג יחס שחרור של 1:10, הוסף 12 זכרים מהונדסים, 120 זכרי WT ו -120 נקבות WT בשלב הגולם לכל כלוב לשכפל.
הערה: ניתן לבדוק יחסי שחרור שונים (1:1, 1:3, 1:10 וכו') ומספר היתושים המשמשים ליזום הניסויים משתנה בהתאם. עם זאת, חשוב לשקול את ההשפעות של מספרים נמוכים על ההערכה הסטטיסטית של הנתונים.
- הגדר שני סטים של כלובים משולשים 0.216 מ"ק עבור כל יחס שחרור גברי הרצוי: WT זכר.
- תחזוקת אוכלוסיה וסינון
- ספקו לנשים בנות 4-7 ימים בכל כלוב ארוחת דם באמצעות עכברים מרדים (איור 2A).
- שלושה ימים לאחר ארוחת הדם, הכנס מיכל oviposition בכל כלוב.
- ביצי צוהר במגש זחלים, בחר ~ 240 זחלי instar הראשון (L1) באקראי מכל כלוב, לגדל אותם לבגרות, ולהחזיר אותם לכלובים שלהם בהתאמה.
- ספק ארוחות דם נוספות (2-3) כל 3-4 ימים למבוגרים החדשים יצאו כמתואר בשלב 2.2.1.
הערה: לא מתווספים זכרים מהונדסים נוספים במהלך כל הדורות הבאים. - בחרו בסך הכל 300 זחלים מכל כלוב באקראי והקרינו אותם לנוכחותו של פנוטיפ הסמן הדומיננטי בשלבי הזחלים והפופלים באמצעות מיקרוסקופ סטריאו פלואורסצנטי וציון מבוגרים מתעוררים למין (איור 3).
הערה: כמו קודם, ההקרנה הפנוטיפי יהיה תלוי הסמן הדומיננטי ומקדם הכלול במערכת כונן הגנים משולב יתושים מהונדסים (למשל, DsRed, CFP או GFP). אם הפרעות הומוזיגוס או הטרואליות של הגנים הממוקדים גורמות לפנוטיפ גלוי (לדוגמה, גנים הקשורים לפיגמנטציה בעיניים), הקרנת תכונה זו תהיה תלויה באיזה שלב הכי קל לדמיין את הפנוטיפ שהשתנה. - פעל לפי פרוטוקול זה במשך דורות רבים ככל שנדרש על ידי פרמטרי התוצאה המוגדרים בתכנון הניסויי.
הערה: כל דור (מופרד על ידי ארוחת הדם) לוקח ~ שלושה שבועות. הניסוי מסתיים בדרך כלל כאשר כל היתושים נחשבים הומוזיגוס עבור מבנה כונן גנים או האוכלוסיות להתייצב באחוז מרבי של יתושים הנושאים לפחות עותק אחד של מבנה כונן גנים.
3. ניסויי דור לא חופפים של יתושים המונעים על ידי גנים (איור 5).
- הגדרת כלוב
- הגדר אוכלוסיות כלוב משולשות של 0.005 מ"ק עבור כל יחס שחרור ספציפי של טרנסגנים לזכרי WT שייחקר (לדוגמה, שלושה סטים של כלובים משולשים שכל אחד מהם מוגדר עם יחסי שחרור של 1:1, 1:3, 1:10). להקים את כל הכלובים עם מספר שווה של זכרים ונקבות.
הערה: הקובץ המשלים הוא וידאו המדגים את בניית כלוב המושבה 0.005 מ"ק .- הוסף 50 זכרים מהונדסים, 50 זכרי WT, ו -100 נקבות WT לכל אחד משלושה כלובים לשכפל כדי להשיג יחס שחרור גברי 1:1.
- הוסף 25 זכרים מהונדסים, 75 זכרי WT, ו -100 נקבות WT לכל אחד משלושה כלובים לשכפל כדי להשיג יחס שחרור גברי 1:3.
- הוסף 9 זכרים מהונדסים, 90 זכרי WT, ו -100 נקבות WT לכל אחד משלושה כלובים לשכפל כדי להשיג יחס שחרור גברי 1: 10.
הערה: ניתן לבדוק יחסי שחרור שונים ומספר היתושים המשמשים ליזום את הניסויים יכול להשתנות בהתאם. עם זאת, חשוב לשקול את ההשפעה של מספר נמוך של יתושים על הניתוחים הסטטיסטיים. אלה הם מהדורות בודדות; לא מתווספים זכרים מהונדסים נוספים בכל הדור הבא.
- הגדר אוכלוסיות כלוב משולשות של 0.005 מ"ק עבור כל יחס שחרור ספציפי של טרנסגנים לזכרי WT שייחקר (לדוגמה, שלושה סטים של כלובים משולשים שכל אחד מהם מוגדר עם יחסי שחרור של 1:1, 1:3, 1:10). להקים את כל הכלובים עם מספר שווה של זכרים ונקבות.
- תחזוקת אוכלוסיה וסינון
- ספקו לנשים בנות 4-7 הימים בכל כלוב ארוחות דם באמצעות מנגנון האכלה מלאכותי (איור 2B) ביומיים רצופים.
הערה: ארוחות דם שגרתיות עבור נקבות מורכבות ממקור דם זמין מסחרית (למשל, דם עגל) המסופק ממנגנון האכלה. עכברים חיים מרדים משמשים רק כדי לספק קמות דם בפורמטים גדולים יותר (0.216 מ"ק) כלוב לביצועי האכלה טובים יותר. - מוסיפים מיכל oviposition 3 ימים לאחר נקמת הדם השנייה. לאחר שלושה ימים, להסיר את מיכלי oviposition.
הערה: בשלב זה, 5-10 נקבות ניתן לבחור באקראי מכל כלוב להציב בנפרד בקבוקונים כדי להעריך פרמטרים כושר נוספים, כגון פוריות ופוריות, במידת הצורך. - ציון על ידי סקס כל המבוגרים (מתים וחיים) נשארים בכלוב ולאחסן אותם ב -80 מעלות צלזיוס לניתוח מולקולרי.
- ביצי צוהר ובחרו באקראי 200 זחלי L1 מכלובי היחס 1:1 ו-1:3 כדי לאכלס כלובים חדשים לדור הבא.
הערה: בשל התדירות הנמוכה של האדם מהונדס מתחיל בכלובי יחס 1:10, דגימה אקראית עלולה להוביל לאובדן מוגזם של צאצאים מהונדסים בדור הבא כדי להמשיך את האוכלוסייה. - כדי להבטיח דגימה מדויקת לכלובים של 1: 10 ומספרים מספיקים של יתושים מהונדסים, מסך את כל הזחלים עבור הסמן הדומיננטי ובחר 200 זחלים המשקפים את תדירות הטרנסג'ן הנצפית כדי לאכלס את הכלובים החדשים.
הערה: הכלובים של 1:10 ניתנים לתחזוקה זהה לכלובים 1:1 ו-1:3 כאשר הם מגיעים לתדר טרנסג'ן של ≥80%. - בחר 500 זחלים מכל כלוב באקראי לניתוח מעמיק. מסך תחת מיקרוסקופ סטריאו פלואורסצנטי עבור פנוטיפים הסמן הצפוי בשלבי הזחל והפפאל וציון מין של מבוגרים (איור 3).
הערה: פנוטיפים 'יוצאי דופן' ניתן לבחור כדי להיות חצה נוסף וניתח מולקולרית כדי לפקח על היווצרות אלל עמיד. - פרוטוקול זה יכול להיות אחריו במשך דורות רבים ככל הנדרש על ידי הפרמטרים התוצאה המוגדרים בעיצוב ניסיוני.
הערה: כל דור מופרד על ידי דם ונמשך ~ שלושה שבועות. הניסוי מסתיים בדרך כלל כאשר כל היתושים נחשבים הומוזיגוס עבור מבנה כונן גנים או אוכלוסיות להתייצב בשכיחות מקסימלית של יתושים מהונדסים. וכמו קודם, הקרנה עבור פנוטיפים יהיה תלוי סמנים דומיננטיים מקדם משולב יתושים מהונדסים (למשל, DsRed, CFP, GFP) או בגנים ממוקדים אם הם מציגים פנוטיפ גלוי (למשל, גנים הקשורים פיגמנטציה העין).
- ספקו לנשים בנות 4-7 הימים בכל כלוב ארוחות דם באמצעות מנגנון האכלה מלאכותי (איור 2B) ביומיים רצופים.
Representative Results
יתושים אנופלינים מהונדסים שנוצרו לשאת כונן שאינו גנים או שינויים כונן גנים אוטונומיים מוגדרים לניסויים בכלוב כמתואר בסעיף פרוטוקולים. התוצאות הייצוגיות המוצגות כאן מתארות את הדינמיקה הפנוטיפ של המשכפלים בעלי הביצועים הטובים ביותר של כל אחד מניסויי הכלוב שבוצעו על ידי Pham et al. (2019) 2 ליתושים של אנופלס סטיבנסי . שלושת הניסויים (1 - 3, בהתאמה: כונן לא-גנטי מוצף, כונן גנים חופף וכונן גנים לא חופף) השתנו בפרמטרים שונים, כגון גודל הכלוב (0.216 מ"ק לעומת 0.005 מ"ק), בין אם אוכלוסיית היעד הייתה בנויה לגיל, מקור ארוחת דם (עכברים או מאכיל מלאכותי) ויחסי שחרור. כאמצעי ייצוג, איור 6 מציג את הנתונים הנצפים שנבחרו מאותו יחס שחרור (1:1) עבור כל שלושת הפרוטוקולים בהם נעשה שימוש, במהלך שבעה דורות.
המהדורה ללא כונן 1:1 מגיעה >80% מבוא טרנסג'ן בתוך 6-7 דורות. עבור ניסויי כלוב מהונדסים של כונן גנים, מהדורות ה- 1:1 בפרוטוקולים שאינם חופפים וחופפים מגיעות לרמה זו בתוך 3-4 דורות, ובכך, ובכך מאמתות את הציפייה כי שחרור יחיד של מערכת כונן גנים יכול להיות יעיל יותר מאשר שחרורים מוצפים שאינם כונן עבור הקדמה טרנסג'נית. המסלול המהיר יותר יכול להיות מאושר גם על ידי השיפוע של קווי המגמה. שני פרוטוקולי כונן הגנים, למרות סטים שונים, מציגים זוויות דומות ומגמות שיפוע. בסוף התצפית, כלובים שאינם מונעים משיגים ~ 80% מהאנשים הנושאים את הטרנסג'ן, בעוד כלובים עם אנשים כונן גנים להגיע מבוא מלא (או כמעט שלם). נתונים מלאים ופרטי עיבוד על תוצאות ניסוי בודדות באמצעות הפרוטוקולים המתוארים כאן ניתן למצוא באיורים 1-3 של Pham et al. (2019) 2, איורים 2-3 של קרבלאר-ליירזו ואח'. (2020) 3 ואיור 3 של אדולפי ואח '. (2020) 4.
איור 1. סכמטי ניסוי שחרור מוצפת ללא כונן. תשעה כלובים בגודל 0.216 מ"ק מוקמים עם 60 זחלי אינסטאר שני מסוג בר (מינים מעורבים) שנוספו לכל אחד מהם. החל משבוע 3, הנקבות מסופקות מדי שבועי של דם וביצים נאספות וקעו. עד שבוע 8, 60 זחלים נבחרים באופן אקראי ומוחזרים לכלובים שלהם בהתאמה כל שבוע כדי ליצור אוכלוסייה בנויה גיל בכלובים (שלב ראשוני). החל משבוע 9, תשעת הכלובים מוקצים באופן אקראי במשולש על פי יחסי השחרור הגבריים הטרנסגניים שלהם:פראיים (שלב ניסיוני). לכלובים A (בקרה) לא נוספו גלמים מהונדסים. הנקבות סופקות מדי שבוע קם דם וביצים נאספות, בוקעות וגידול לגולם. 30 גברים ו-30 גלמים פראיים מתווספים בחזרה לכלובים שלהם. לכלובים 1:1 יש עוד 30 גלמים זכרים מהונדסים. לכלובים 1:0.1 יש עוד 300 גלמים זכרים מהונדסים. 300 זחלים מכל אחד מתשעת הכלובים נבחרים באופן אקראי ומוקרנים עבור הסמן הפלואורסצנטי. הליך זה חזר על עצמו שבועי עד קיבעון טרנסג'נים (יחס מיוצב של יתושים מהונדסים-בר לאחר כמה דורות). עיבוד מ"פאם ואח'". (2019) 2. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2. האכלת דם של אוכלוסיות כלוב. (A) עכברים מרדים או (B) מזיני דם Hemotek מוצעים עבור האכלת דם יתושים נקבה על כלובים 0.216 מ"ק או כלובים קטנים 0.005 m3 , בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3. סינון פנוטיפים עבור ניסויים שאינם כונן, כונן גנים חופף וניסויים כלוב כונן גנים שאינם חופפים. תמונות פלואורסצנטיות של זחל, גולם ומבוגר של פנוטיפים מהונדסים או פראיים. בדוגמה זו, אנשים An. stephensi נבדקו עבור סמן DsRed מונע על ידי מקדם 3xP3 בעיניים (DsRed + או DsRed-), גלוי בכל שלושת השלבים, ומבוגרים הוקרנו לסקס ( ♀ או ♂ ). שימו לב לפלואורסצנטיות ברקע בזחלים מסוג בר הקשורים לבולוס המזון באמצע. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4. סכמטי ניסוי כלוב חופף של כונן גנים. שישה כלובים בגודל 0.216 מ"ק מוקמים בשלישייה בהתאם ליחסי השחרור הגבריים שלהם מסוג בר. 120 זכרים פראיים ו-120 נקבות פראיות נוספו לכל כלוב. לכלובים עם יחס שחרור גברי של 1:1 היה עוד 120 זכרים מהונדסים. לכלובים עם יחס שחרור גברי של 1: 10 נוספו עוד 12 זכרים מהונדסים. עד להקדמה מלאה של transgene, כל 3 שבועות, נקבות בוגרות מסופקות עם דם וביצים נאספים ובקעו. בסך הכל נבחרו 240 זחלים באקראי והוחזרו לכלובים שלהם. 300 (300) זחלים נבחרים באופן אקראי ומוקרנים עבור הסמן הדומיננטי. מאוחר יותר הם מוקרנים כמו גלמים ומבוגרים עבור צבע עיניים ומין. לא מתווספים זכרים מהונדסים נוספים לכלובים המקוריים. עיבוד מ"פאם ואח'". (2019) 2. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5. סכמטי ניסוי כלוב לא חופף של כונן גנים. תשעה כלובים קטנים בגודל 0.005 מ"ק מוקמים בשליפליקאט בהתאם ליחסי השחרור הגבריים שלהם מסוג בר. בכלובים עם יחס שחרור גברי של 1:1 יש 100 נקבות פראיות, 50 זכרים פראיים, ו-50 זכרים בעלי הנעת גנים. בכלובים עם יחס שחרור של גברים 1:3 יש 100 נקבות מסוג בר, 75 זכרים פראיים, ו-25 זכרים בעלי הנעת גנים. בכלובים 1: 10 יחס שחרור זכר יש 100 נקבות סוג בר, 90 זכרים מסוג בר, ו 9 זכרים כונן גנים הוסיף. הנקבות סופקות ארוחת דם וביצים נאספו ובקעו. עבור כלובים 1:1 ו-1:3, 200 זחלים נבחרים באופן אקראי ומשמשים לאכלוס כלובים חדשים, בנפרד מזה של הוריהם, לדור הבא. 500 זחלים נוספים נבחרים באופן אקראי וגידול לגולם, כאשר הם נבדקים עבור גן הסמן הדומיננטי. 500 הגולם גדלים למבוגרים ומושגים על ידי סקס. כל הזחלים הנותרים נבדקים עבור הסמן. עבור הכלובים של 1: 10, כל הזחלים מקבלים ציון בדורות 1-12 ו-200 זחלים המשקפים את תדר הטרנסג'ינים הקיים משמשים לאכלוס כלובים חדשים. החל מדור 13, הכלובים האלה מוגדרים באופן זהה לכלובים 1:1 ו-1:3. עיבוד מ"פאם ואח'". (2019) 2 ו קרבאלר-ליירזו ואח'. (2020) 3. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6. דינמיקת קיבוע טרנסג'ן חזויה לניסויי כלוב שונים להחלפת אוכלוסין. ייצוג הדינמיקה הפנוטיפית הצפויה של המשכפלים בעלי הביצועים הטובים ביותר עבור כל אחד מניסויי הכלוב שבוצעו על ידי Pham et al. (2019) 2, במעקב במשך 7 דורות. ניסויים שהוגדרו מתוארים בפרוטוקולים. התחזיות מבוססות על נתונים מכל 9 הניסויים במודלים של שחרור 1:1 (טריפליק משכפל עבור כל אחד משלושת פרוטוקולי ניסוי הכלוב השונים). ציר ה- X הוא מספר הדור לאחר ההקדמה הראשונית וציר ה- Y הוא חלק מהזחלים המציגים את פנוטיפ סמן DsRed (DsRed+) לאורך זמן. קווים מקווקווים מייצגים קווי מגמה ליניאריים של הנתונים. הפנוטיפ DsRed+ נובע מכך שיש לפחות עותק אחד של אלל שונה. מכאן התוצאות משקפות את התפשטות הטרנסג'ן, מזורזת במערכת הנעת הגנים, ומגיעות (קרוב) להקדמה מלאה בסוף התצפית. לקבלת השונות בין שכפולים ונתונים מפורטים מלאים על הניסויים, עיין ב- Pham et al. (2019) 2, קרבאלר-לג'ארזו R ואח' (2020)3 ואדולפי א ואח' (2020)4. תמונות המותאמות מ- Pham TB ואח ' (2019) שינוי אוכלוסין ניסיוני של יתוש וקטור המלריה, אנופלס סטיבנסי. PLOS Genet 15(12): e1008440. doi: 10.1371/journal.pgen.1008440, אדולף A ואח ' (2020) מערכת יעילה להצלת גנים לשינוי האוכלוסייה יתוש המלריה אנופלס סטיבנסי. נט קומונה 11(1): 5553. doi: 10.1038/s41467-020-19426-0 ו Carballar-Lejarazú R ואח ' (2020) כונן גנים הדור הבא לשינוי האוכלוסייה של יתוש וקטור מלריה, אנופלס גמביה. פרוצדורה נטל Acad Sci ארה"ב 117(37):22805-22814. doi: 10.1073/pnas.2010214117. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
קובץ משלים: בניית כלוב המושבה 0.005 מ"ק. נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Discussion
יתושים מהונדסים גנטית בעלי יכולת חסימת פתוגן או גנים של סטריליות דובים מהווים כלים חדשים לשליטה במחלות המועברות בווקטורים. בהתחשב בריבוי הפרמטרים המרכיבים גישות חלופיות אלה, שלב קריטי במחקר שלהם מורכב מהערכות ניסיוניות מוגבלות במעבדה המאפשרות חיזוי מהיר ובטוח של התוצאות הפוטנציאליות של שחרור טרנסג'ן סינתטי למטרות בקרה1.
מכיוון שניטור הדינמיקה הטרנסג'נית באוכלוסיות בכלוב יכול להימשך מספר חודשים, אחד ההיבטים המרכזיים של הפרוטוקולים הוא העקביות בעיצוב ניסיוני בין שכפולים (כולל גידול יתושים, גודל כלוב, אוכלוסיות בנויות גיל, יחסי שחרור קבועים, מקורות ארוחות דם יציבים והליכי סינון זעיר פולשניים).
שחרורים לגברים בלבד נחשבים אידיאליים מכיוון שהיתושים הזכרים אינם מעבירים פתוגנים ואינם ניזונים מבני אדם, ולכן הם יכולים להכניס בבטחה מאפיינים תורשתיים לאוכלוסיות בר. בניסויים בכלוב מעבדה, ניתן לזהות זנים מהונדסים עם תחרותיות הזדווגות גברית מופחתת ועומסי כושר אחרים הקשורים לשילוב טרנסג'נים. עם זאת, ניסויים ישירים וספציפיים, כגון אלה שנערכו בכלובים גדולים10, יכולים להתבצע כדי לנתח כראוי את התחרותיות הגברית, כמו גם את פוריות נשית בצפיפות יתושים טבעית יותר2. יתר על כן, נתונים אמפיריים מניסויי הכלוב יכולים לשמש כדי לפרמטרים מודלים של דינמיקת אוכלוסיית הכלוב, כולל היווצרות אלל עמידה, ולספק מידע שימושי על יעילות והתאמות אפשריות בטכנולוגיה המוצעת.
הפרוטוקולים המתוארים כאן יכולים להיות מותאמים בקלות לתכנונים ניסיוניים אחרים כנדרש, עם דרישות מינימליות לגבי תשתית ותנאים רגילים של חרקים. בנוסף, למעט הכלובים המסחריים והמיקרוסקופים, רוב החומרים זולים ומאפשרים שכפולים מרובים בעלות נמוכה ואיטרציות של הניסויים. ראוי לציין, זה גם מאפשר זנים מהונדסים מרובים להיות מוקרן מראש בניסויים בכלוב קטן על מנת לתעדף מועמדים בעלי הביצועים הטובים ביותר להיות מועברים קדימה במסלול הבדיקה בשלבים ולהשעות בדיקות על אלה המציגים ביצועים תת אופטימליים.
לבסוף, החשש לגבי השימוש באורגניזמים מהונדסים גנטית מניע את פירוט המסגרות לפיתוח, הערכה ויישום של אסטרטגיות גנטיות למניעת מחלות המועברות על ידי יתושים5,8,9. הרלוונטיות והביצוע של הפרוטוקולים המוגדרים כאן עולים בקנה אחד עם הנחיות אלה.
Disclosures
למחברים אין גילויים.
Acknowledgments
אנו מודים לדרוסילה סטילינג'ר, קיונה פרקר, פאריש פאוול ומדלין נוטולי על גידול יתושים. המימון ניתן על ידי יוזמת מלריה של אוניברסיטת קליפורניה אירוויין. AAJ הוא פרופסור דונלד ברן באוניברסיטת קליפורניה, אירווין.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Artificial feeders | Hemotek | SP6W1-3 | Starter pack – 6 feeders with 3ml reservoirs |
| Cage, commercial | BioQuip | 1450D | Collapsible Cage, 24 X 24 X 24" - 0.216 m3 (60 cm3) |
| Cage tub (popcorn) | Amazon.com | VP170-0006 | 0.005 m3 (170 fl oz) |
| Dissecting microscope with fluorescence light and filters | Leica | M165FC | |
| Glue sticks | Michaels | 88646598807 | Gluesticks 40 pk, 0.4X4” |
| Hot glue gun | Woodwards Ace | 2382513 | Stanley, 40 watt, GR20 |
| Nylon screen (netting) | Joann.com | 1102912 | Tulle 108" Wide x 50 Yds - ~35.6 cm2 (14 in2) |
| Oviposition cups | Fisher | 259126 | Beaker PP grad 50 mL |
| Razor cutting tool | Office Depot | 487899 | Box cutters |
| Scissors | Office Depot | 978561 | Scotch Precision Ultra Edge Titanium Non-Stick Scissors, 8" |
| Stapler | Office Depot | 908194 | Swingline Commercial Desk Stapler |
| Surgical sleeve (stockinette) | VWR | 56612-664 | ~48 cm (19”) cut from bolt ~15 cm (6”) X ~23 m (25y) |
| Zip ties | Home Depot | 295715 | Pk of 100, 14” cable ties - 35.6 cm (14 in) |
References
- Carballar-Lejarazú, R., James, A. A. Population modification of Anopheline species to control malaria transmission. Pathogens and Global Health. 111 (8), 424-435 (2017).
- Pham, T. B., et al. Experimental population modification of the malaria vector mosquito, Anopheles stephensi. PLOS Genetics. 15 (12), 1008440 (2019).
- Carballar-Lejarazú, R., et al. Next-generation gene drive for population modification of the malaria vector mosquito, Anopheles gambiae. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (37), 22805-22814 (2020).
- Adolfi, A., et al. Efficient population modification gene-drive rescue system in the malaria mosquito Anopheles stephensi. Nature Communications. 11 (1), 5553 (2020).
- Akbari, O. S., et al. Safeguarding gene drive experiments in the laboratory. Science. 349 (6251), 927-929 (2015).
- Benedict, M. Q., et al. Recommendations for Laboratory Containment and Management of Gene Drive Systems in Arthropods. Vector-Borne and Zoonotic Diseases. 18 (1), 2-13 (2018).
- CDC/NIH Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. (6th Edition). , Available from: http://www.cdc.gov/labs/pdf/SF_19_308133-A_BMBL6_00-BOOK-WEB-final-3.pdf 1 (2020).
- Adelman, Z., et al. Rules of the road for insect gene drive research and testing. Nature Biotechnology. 35 (8), 716-718 (2017).
- Long, K. C., et al. Core commitments for field trials of gene drive organisms. Science. 370 (6523), 1417-1419 (2021).
- Facchinelli, L., North, A. R., Collins, C. M., et al. Large-cage assessment of a transgenic sex-ratio distortion strain on populations of an African malaria vector. Parasites Vectors. 12, 70 (2019).
