Macropinocytosis هي عملية داخل الخلايا محفوظة للغاية تبدأ من خلال تشكيل إسقاطات غشائية غنية بالصفائح F-actin ، والمعروفة أيضا باسم كشكشة الغشاء. وقد تورط معدل زيادة الاستيعاب المذاب macropinocytotic في مختلف الظروف المرضية. يقدم هذا البروتوكول طريقة لقياس تكوين كشكشة الغشاء في المختبر باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تصور تشكيل غشاء الكشكشة باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
كشكشة الغشاء هي تكوين نتوءات غشاء البلازما المتحركة التي تحتوي على شبكة من خيوط الأكتين المبلمرة حديثا. قد تتشكل الكشكشة الغشائية تلقائيا أو استجابة لعوامل النمو والسيتوكينات الالتهابية واسترات الفوربول. قد يعاد تنظيم بعض نتوءات الغشاء في كشكشة غشائية دائرية تندمج في هوامشها البعيدة وتشكل أكوابا تغلق وتنفصل في السيتوبلازم على شكل فجوات كبيرة غير متجانسة تسمى macropinosomes. أثناء هذه العملية ، تحبس الكشكشة السائل خارج الخلية والمذابات التي تستوعب داخل macropinosomes. المجهر الإلكتروني الماسح عالي الدقة (SEM) هو تقنية تصوير شائعة الاستخدام لتصور وقياس تكوين كشكشة الغشاء ، والنتوءات الدائرية ، وأكواب المحببات الكبيرة المغلقة على سطح الخلية. يصف البروتوكول التالي ظروف زراعة الخلايا ، وتحفيز تكوين كشكشة الغشاء في المختبر ، وكيفية إصلاح الخلايا وتجفيفها وإعدادها للتصوير باستخدام SEM. كما يتم وصف القياس الكمي لكشكش الغشاء ، وتطبيع البيانات ، والمحفزات والمثبطات لتشكيل كشكشة الغشاء. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية حول دور ندرة الخلايا الكبيرة في العمليات الفسيولوجية والمرضية ، والتحقيق في الأهداف الجديدة التي تنظم تكوين كشكشة الغشاء ، وتحديد المحفزات الفسيولوجية غير المميزة حتى الآن بالإضافة إلى مثبطات دوائية جديدة ل macropinocytosis.
المقدمة
Macropinocytosis هي عملية endocytic مسؤولة عن استيعاب كمية كبيرة من السائل خارج الخلية ومحتواه عن طريق تشكيل نتوءات غشاء البلازما الديناميكية والمدفوعة بالأكتين والتي تسمى كشكشة الغشاء1. تشكل العديد من هذه الكشكشة الغشائية أكوابا تغلق وتندمج مرة أخرى على الخلية وتنفصل عن غشاء البلازما كإيدوسومات كبيرة غير متجانسة داخل الخلايا تعرف أيضا باسم macropinosomes1. على الرغم من أن ندرة الخلايا الكبيرة تسببها عوامل النمو مثل عامل تحفيز مستعمرة البلاعم (M-CSF) وعامل نمو البشرة (EGF) في مجموعة واسعة من أنواع الخلايا ، فقد لوحظت أيضا عملية إضافية فريدة تعتمد على الكالسيوم تعرف باسم macropinocytosis التأسيسي في الخلايا المناعية الفطر....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
ملاحظة: فيما يلي بروتوكول عام يستخدم لقياس تكوين كشكشة الغشاء في البلاعم RAW 264.7 باستخدام الفحص المجهري SEM. قد يكون التحسين مطلوبا لأنواع الخلايا المختلفة.
1. خط الخلية وزراعة الخلايا
- تنمو البلاعم RAW 264.7 في وسط النسر المعدل (DMEM) من Dulbecco مع 10٪ (vol / vol) مصل البقر الجنيني المعطل حراريا (FBS) ، و 100 وحدة دولية / مل من البنسلين و 100 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين في حاضنة رطبة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2. استبدال وسائط النمو كل يومين.
- عندما تصبح الخلايا ملتقية بنسبة 80٪ ، اغسل اللوحة مرتين باستخدام PBS المعقمة.
- افصل الخلايا عن طريق إضافة 1000 ميكرولتر من 0.5٪ من التربسين-EDTA واحتضن لوح....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
هنا ، نصف النتائج من التقنية المقدمة. توضح صور SEM التمثيلية الموضحة في الشكل 1 تكوين كشكشة الغشاء في البلاعم RAW 264.7 بعد العلاج باستخدام PMA و M-CSF. تم التقاط الصور لأول مرة بتكبير 3,500x لأغراض القياس الكمي ثم عند مستويات أعلى من التكبير (8,500x إلى 16,000x) لإظهار غشاء البلازما بمزيد من التفاصيل. المعالجة المسبقة للبلاعم مع مثبط ندرة الخلايا الكبيرة EIPA تشكيل كشكشة الغشاء الموهن (الشكل 1). يمكن تقسيم أنشطة غشاء البلازما المرتبط بكثرة الخلايا الماكروبينية .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يوفر بروتوكول التصوير SEM الحالي أداة لتصور وقياس تكوين كشكشة الغشاء ، والنتوءات الدائرية ، والأكواب ذات الخلايا الكبيرة على سطح الخلية في المختبر. على الرغم من أن البروتوكول الحالي يركز على البلاعم ، فقد أظهرت الدراسات أن تكوين كشكشة الغشاء يحدث أيضا على أنواع مختلفة من الخلايا الأخرى بما في ذلك الخلايا المتغصنة والخلايا الليفية والخلايا العصبية والخلايا السرطانية 11،12،14،21،
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ويعلن صاحبا البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
يشكر المؤلفون ليبي بيري (جامعة أوغوستا) على مساعدتها في إعداد عينة SEM. تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة [R01HL139562 (G.C.) و K99HL146954 (B.S.)] وجمعية القلب الأمريكية [17POST33661254 (B.S.)].
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 0.5٪ Trypsin-EDTA | Gibco | 15400-054 | |
| 2٪ علوم المجهر الإلكتروني الجلوتارالديهايد | 16320 | ||
| 4٪ بارافورمالدهيد | سانتا كروز التكنولوجيا الحيوية | 281692 | |
| 5- (N-ethyl-N-isopropyl) -Amiloride | Sigma Life Science | A3085 | |
| Accuri C6 مقياس التدفق الخلوي | |||
| علامات تبويب لاصقة الكربون | علوم المجهر الإلكتروني | 77825-09 | |
| ثنائي ميثيل سلفوكسيد | كورنينج | 25-950-CQC | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Cytiva Life Sciences | SH30022.01 | |
| Falcon 24-well Clear Flat Bottom Treated TC Multiwell Cell Culture Plate | Falcon | 353047 | |
| مصل الأبقار الجنين | Gemini Bio | 900-108 | |
| FitC-dextران | Thermo Fisher Scientific | D1823 | |
| FM 4-64 | Thermo Fisher Scientific | T13320 | |
| HERAcell 150i حاضنة CO2 | Thermo Fisher Scientific | 51026282 | |
| Hummer Model 6.2 Sputter Coater | Anatech USA | 58565 | |
| JSM-IT500HR مجهر | إلكتروني المسح | ||
| غطاء مجهر | زجاجي ثيرمو فيشر علمي | 12-545-82 | |
| قلم Strep | Gibco | 15140-122 | |
| phorbol 12-myristate 13-acetate | Millipore Sigma | 524400 | |
| RAW 264.7 macrophage | ATCC | ATCC TIB-71 | |
| مؤتلف بشري M-CSF | Peprotech | 300-25 | |
| Samdri-790 مجفف النقطة الحرجة | أبحاث Tousimis | 8778B | |
| SEM عينة الألومنيوم يتصاعد علوم | المجهر الإلكتروني | 75220 | |
| المجهر | الكاكوديلات الصوديوم | 12300 | |
| تكساس أحمر دإكسترا | ثيرمو فيشر العلمي | D1864 | |
| تريبان الحل الأزرق | ثيرمو فيشر العلمي | 15250061 | |
| متحد البؤر Zeiss LSM 780 |
المراجع
- Bohdanowicz, M., Grinstein, S. Role of phospholipids in endocytosis, phagocytosis, and macropinocytosis. Physiological Reviews. 93 (1), 69-106 (2013).
- Canton, J. Macropinocytosis: New Insights Into Its Underappreciated Role....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
