그래디언트 메이커 또는 분획 시스템이 없는 폴리솜 프로파일링

요약

이 프로토콜은 자동화된 그래디언트 메이커 또는 그래디언트 분별 시스템을 사용하지 않고 폴리솜 프로파일을 생성하는 방법을 설명합니다.

초록

자당 밀도 구배 원심분리에 의한 폴리솜 분획은 리보솜 프로파일을 생성하고, 리보솜에 의해 번역되는 특정 mRNA를 식별하고, 폴리솜 관련 인자를 분석하는 데 사용할 수 있는 강력한 도구입니다. 자동화된 그래디언트 메이커와 그래디언트 분획 시스템이 일반적으로 이 기술과 함께 사용되지만 이러한 시스템은 일반적으로 비용이 많이 들고 자원이 제한되어 있거나 연구를 위해 이 방법을 드물게 또는 가끔 수행해야 하기 때문에 비용을 정당화할 수 없는 실험실의 경우 비용이 많이 들 수 있습니다. 여기에서는 특수 분획 기기 없이 대부분의 분자 생물학 실험실에서 사용할 수 있는 표준 장비를 사용하여 폴리솜 프로파일을 재현 가능하게 생성하는 프로토콜이 제시됩니다. 더욱이, 그래디언트 분별 시스템의 유무에 관계없이 생성된 폴리솜 프로파일의 비교가 제공된다. 재현 가능한 폴리솜 프로파일을 최적화하고 생산하기 위한 전략이 논의됩니다. 사카로미세스 세레비시아는 이 프로토콜에서 모델 유기체로 활용됩니다. 그러나 이 프로토콜은 다양한 유기체 및 세포 유형에 대한 리보솜 프로파일을 생성하도록 쉽게 수정 및 조정할 수 있습니다.

서론

리보솜은 mRNA를 단백질로 번역하는 기본 과정을 수행하는 메가 달튼 리보 핵 단백질 복합체입니다. 리보솜은 세포 내의 모든 단백질 합성을 수행하는 역할을합니다. 진핵 생물 리보솜은 침강 계수에 따라 작은 리보솜 소단위 (40S)와 큰 리보솜 소단위 (60S)로 지정된 두 개의 하위 단위로 구성됩니다. 완전히 조립 된 리보솜은 80S 모노 솜으로 지정됩니다. 폴리솜은 단일 mRNA 분자를 번역하는 데 관여하는 리보솜 그룹입니다. 자당 밀도 구배 원심분리에 의한 폴리솜 분획은 리보솜 프로파일을 생성하고, 리보솜 번역과 관련된 특정 mRNA를 식별하고, 폴리솜 관련 인자 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12를 분석하는 데 사용되는 강력한 방법입니다.<....

프로토콜

1. 7% - 47% 자당 구배의 제조

참고: 자당 구배의 선형 범위는 사용된 세포 유형에 따라 더 나은 분리를 달성하도록 수정할 수 있습니다. 이 프로토콜은 S. cerevisiae의 폴리솜 프로파일에 최적화되어 있습니다.

1. 슈크로스 구배 완충액 (20 mM Tris-HCl pH 7.4, 60 mM KCl, 10 mM_MgCl2 및 1 mM DTT) 중에서 7% 및 47% 슈크로스의 스톡 용액을 준비한다. 필터는 0.22 μm 필터를 통해 슈크로스 원액을 멸균하고 4°C에서 보관한다.
2. 표 1에 기재된 방식으로 7% 및 47% 슈크로스 스톡 용액을 분주 및 혼합하여 17%, 27% 및 37% 슈크로스 용액 14mL를 준비한다.
3. 6개의 폴리프로필렌 원심분리기 튜브(14 x 89mm)를 전체 보기 시험관 랙에 놓습니다. 한 튜브의 동작이 다른 튜브를 방해하지 않도록 튜브 사이에 충분한 공간을 확보하십시오.
4. 3mL 주사기에 긴 바늘을 부착합니다. 이 프로토콜의 경우 끝이 뭉툭한 9인치, 22G 바늘을 사용하되(그림 1) 원심분리 튜브의 바닥에 도달할 만큼 충분히....

결과

세 가지 대표적인 폴리솜 프로파일이 그림 3에 나와 있습니다. 모든 프로파일은 동일한 효모 균주에서 추출됩니다. 일반적인 폴리솜 프로파일은 40S, 60S 및 80S 리보솜 서브유닛과 폴리솜에 대해 잘 분해된 피크를 갖습니다. 각 리보솜 서브 유닛의 마루와 폴리솜 피크는 각 프로파일에서 분명합니다 (그림 3). 자동화된 밀도 분별 시스템으로부터의 대표적인 프로파일이 도 3A에 도시되어 있다. 이 프로파일을 생성하기 위해 사용된 슈크로스 그래디언트는 이 프로토콜에 기재된 바와 같이 수작업으로 제조하였다. 도 3A에 도시된 이 프로파일은 수크로스 구배가 검출기 유동 셀을 통해 체이스 용액에 의해 아래에서 위로 변위되고 분획으로 수집됨에 따라 연속적인 흡광도 프로파일로부터 생성되었다. 이러한 시스템은 흡광도를 지속적으로 측.......

토론

여기에서는 값비싼 자동 분별 시스템을 사용하지 않고 폴리솜 프로파일을 생성하는 방법이 설명되었습니다. 이 방법의 장점은 자동화된 분획 시스템이 없는 실험실에서 폴리솜 프로파일링에 액세스할 수 있다는 것입니다. 이 프로토콜의 주요 단점은 지루한 손 분획과 전용 밀도 분별 시스템에 비해 감도가 감소한다는 것입니다.

이 프로토콜은 리보솜 서브 유닛, 모노 솜 및 폴리 솜을 분리하기에 충분한 해상도로 자당 구배의 신중한 준비를 수반합니다. 자당 그라디언트를 준비할 때 그래디언트 레이어를 로드하는 동안 기포를 도입하지 않는 것이 중요합니다. 기포는 아래에서 위로 올라가 그라디언트의 선형성을 방해 할 수 있습니다. 또한 매번 사용하기 전에 바늘 외부를 닦아야하며 각 그라디언트 층의 무결성을 보장하기 위해 과도한 자당 용액을 내강에서 제거해야합니다. 4 ° C에서 그라디언트의 밤새 보관은 차가운 방에서 수행해야합니다. 냉장고에서 압축기를 켜고 끌 때 발생하는 진동은 기울기를 방해할 수 있습니.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
자동 분류기	Brandel
Clariostar 멀티모드 플레이트 리더	BMG Labtech
Cycloheximide	Sigma Aldrich	C7698
Dithiothreitol	Invitrogen	15508-013
유리 구슬, 산성 세척	Sigma Aldrich	G8772	425– 600 &뮤; m
Heparin	Sigma Aldrich	H4784
염화마그네슘, 1 m	KD Medical	CAC-5290
바늘, 22 g, 금속 허브	Hamilton Company	7748-08	사용자 정의 길이 9 인치, 포인트 스타일 3
Optima XL-100K 초원심분리기	Beckman Coulter
폴리프로필렌 원심분리기 튜브	Beckman Coulter	331372
폴리프로필렌 시험관 페그 랙	Fisher Scientific	14-810-54A
염화칼	시그마 Aldrich	P9541
큐비트 4 형광측정기	Thermo Fisher Scientific	Q33228
큐비트 RNA HS 어세이 키트	Thermo Fisher Scientific	Q32855
RNAse 억제제	Applied Biosystems	N8080119
설탕	시그마 알드리치	S0389
SW41 스윙 버킷 로터 패키지	벡크만 쿨터	331336
주사기, 3 mL	코비덴	888151394
트리스, 1 M,  pH 7.4	KD 의료	RGF-3340
트리톤 X-100	시그마 알드리치	X100
UV-스타 마이크로플레이트, 96 웰	Greiner Bio-One

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