Method Article

מדידת ה-pH, הכימיות האדומות והיכולת המשפילה של מקרופאינוזום באמצעות מיקרוסקופיה רציומטרית דו-פלואורופור

DOI:

10.3791/62733

⸱

August 19th, 2021

 , 
1Department of Biochemistry & Microbiology, Faculty of Science, University of Victoria, 2Department of Comparative Biology and Experimental Medicine, Faculty of Veterinary Science, University of Calgary, 3Calvin, Joan and Phoebe Snyder Institute for Chronic Diseases, University of Calgary

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מתארים פרוטוקולים למדידת pH, אירועים חמצוניים ועיכול חלבונים במקרופינוזומים בודדים בתאים חיים. דגשושם על מיקרוסקופיה יחס פלואורופור כפולה ועל היתרונות שהיא מציעה על פני טכניקות מבוססות אוכלוסייה.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בשנים האחרונות, תחום המקרופינוציטוזיס גדל במהירות. מקרופינוציטוזיס התפתח כמנגנון מרכזי שבאמצעותו תאי מערכת החיסון המולדים שומרים על הומאוסטזיס אורגניזם וחסינות. בו זמנית, ובניגוד לתפקידו ההומיאוסטטי, הוא יכול גם לנהוג בפתולוגיות שונות, כולל סרטן וזיהומים ויראליים. שלא כמו מצבים אחרים של אנדוציטוזיס, הכלים שפותחו לחקר ההתבגרות של מקרופאינוזום נשארים לא מפותחים. כאן הפרוטוקול מתאר כלים שפותחו לאחרונה לחקר סביבת redox בתוך הלומן של מקרופאינום מוקדמים ומבשרים. מתודולוגיות לשימוש במיקרוסקופיית פלואורסצנטיות יחסרית בהערכת ה- pH, ייצור מיני חמצן תגובתי ויכולת השפלה בתוך הלומן של מקרופאינוזומים בודדים בתאים חיים מתוארים. מדידות אברונים בודדות מציעות את היתרון של חשיפת הטרוגניות מרחבית, אשר לעתים קרובות הולך לאיבוד עם גישות מבוססות אוכלוסייה. הדגש מושם על העקרונות הבסיסיים של מיקרוסקופיה יחס פלואורופור כפולה, כולל בחירת בדיקה, מכשור, כיול ושיטות חד-תאיות לעומת שיטות מבוססות אוכלוסייה.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מקרופינוציטוזיס מתייחס לספיגת כמויות גדולות של נוזל חוץ-תאי לאברונים ציטופלסמיים הקשורים לממברנה הנקראים מקרופאינוזומים1,2. זהו תהליך שמור מאוד המבוצע על ידי אורגניזמים חד-תאיים חיים חופשיים, כגון אמבה דיקטיוסטליום spp. 3, כמו גם אנתוזואים4 ומטאזואנים2. ברוב התאים, מקרופינוציטוזיס הוא אירוע מושרה. קשירת קולטני פני התא גורמת לבולטות של הרחבות קרום פלזמה מונחות אקטין המכונות קפלים. חלק קטן מאותם קפלים, על ידי מנגנון לא מובן, לאטום את הטיפים הדיסטליים שלהם כדי ליצור macropinosomes (אם כי מעבר להיקף נייר שיטות זה, עבור ביקורות מפורטות....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת תאים

  1. לגדול Raw264.7 תאים ב 37 °C ו 5% CO2 עד 70% השפעה ב RPMI בתוספת 10% סרום מומת בחום.
  2. יום אחד לפני ההסתערות, זרע Raw264.7 תאים בצפיפות של 5 x 104 תאים לבאר בצלחת 96-well. ודא כי כל באר מכילה 100 μL של אמצעי צמיחה. ודא כי צלחת 96 טוב יש צדדים שחורים ותחתית זכוכית להדמיה.
    הערה: כאן, לוחות 96-באר שימשו להדמיה. לוחות 96 בארות מאפשרים שימוש בכמויות קטנות יותר של תאים ריגנטים ביחס לתאי הדמיה גדולים יותר. עם זאת, ניתן להשתמש בכל תא המיועד להדמיית תאים חיים, וניתן להגדיל ריאגנטים בהתאם.
  3. ביום הבדיקה, בדוק אם בארות הם לפחות 70% מפגש.

2. מדידת pH מקרופאינום

  1. הכן את התאים ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בעת מדידת pH macropinosome, יש פרק זמן שבו הדינמיקה של החמצה לא ניתן למדוד. תקופה זו תואמת לשלב הטעינה של dextran (תיבה אפורה באיור 2C ובאיור 3C,D) ותשתנה בהתאם לסוג התא בו נעשה שימוש. אורך שלב הטעינה ישתנה עם (i) הפעילות המקרופינוציטית של התאים ו- (ii) הרגישות של המכשיר המשמש. מומלץ להתאים תקופה זו בתחילת כל ניסוי כך שיחס אות: רעש של גדול מ- 4:1 מושג הן עבור פלואורסצין והן עבור ערוצי TMR. בתאים לא מטופלים, פליטת הפלואורסצ'ין צריכה להיות חלשה יו.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למרות שיש מספר פרוטוקולים למדידות תפוקה נמוכה וגבוהה של ספיגה מקרופינוציטית במקרופסגים, פיברובלסטים ואפילו Dictyostelium spp. 3,7,31,32,33,נעשו מעט מאוד ניסיונות למדוד את הביוכימיה הזוהרת של תאים דינמיים אלה. זה ככל הנראה בשל מחסור של בדיקות שניתן למקד ביעילות לתא המקרופינוסומול תוך הימנעות תאים אנדוציטיים אחרים. מתוארות כאן הטכניקות למקד בדיקות פלואו.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לאוניברסיטת קלגרי על תמיכתה. ברצוננו גם להודות לד"ר רובין ייטס על הגישה לריגנטים, ציוד ודיונים שימושיים.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
צלחת 96 בארות שחורת דופןPerkinElmer6005430
CypHer5e, NHS esterCytivaPA15401
Dextran-amino 70 kDaInvitrogenD1862
DQ-ovalbuminInvitrogenD12053
FITC-dextran 70 kDaInvitrogenD1823
HBSSGibco14287
ניגריציןסיגמא אולדריץ'N7143
OxyBurst Green-SEInvitrogenD2935
pHrodo Red, SEInvitrogenP36600
Raw264.7 תאיםATCCTIB-71
RPMI בינוניGibco11875093
SP5 מיקרוסקופ קונפוקליLeica-
TRITC-dextran 70 kDaInvitrogenD1819
צלחתIbidi81156

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Canton, J. Macropinocytosis: New insights into its underappreciated role in innate immune cell surveillance. Frontiers in Immunology. 9, (2018).
  2. Marques, P. E., Grinstein, S., Freeman, S. A. SnapShot: Macropinocytosis. Cell. 169, 766(2017).
  3. Williams....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Macropinosome pHRedox ChemistriesMacropinosome DegradationRatiometric MicroscopyDual FluorophoreMacropinocytosisReactive Oxygen SpeciesProtein DigestionLive Cell ImagingFluorescence Calibration

Related Articles