Method Article

דור אורגנוידים במוח האדם למידול מחלות מיטוכונדריאליות

DOI:

10.3791/62756

⸱

June 21st, 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of General Pediatrics, Neonatology and Pediatric Cardiology, Duesseldorf University Hospital, Medical Faculty, Heinrich Heine University, 2Institute of Neurobiology, Heinrich Heine University, 3Berlin Institute for Medical Systems Biology (BIMSB), Max Delbrueck Center for Molecular Medicine (MDC), 4Seaver Autism Center for Research and Treatment, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 5Max Delbrueck Center for Molecular Medicine (MDC)

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מתארים פרוטוקול מפורט ליצירת אורגנוידים במוח המושרים תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים והשימוש בהם בדוגמנות מחלות מיטוכונדריאליות.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחלות מיטוכונדריאליות מייצגות את הכיתה הגדולה ביותר של טעויות מולדות של חילוף החומרים, וכיום הן חשוכות מרפא. מחלות אלה גורמות למומים נוירו-פיתוחיים שהמנגנונים הבסיסיים שלהם נותרים להתגלות. מחסום מרכזי הוא היעדר מודלים יעילים המשיבים את הליקוי העצבי המוקדם שנראה בחולים. ההתקדמות בטכנולוגיה של תאי גזע פלוריפוטנטים המושרים (iPSCs) מאפשרת ייצור של אורגנוידים תלת ממדיים (3D) במוח שניתן להשתמש בהם כדי לחקור את ההשפעה של מחלות על הפיתוח והארגון של מערכת העצבים. חוקרים, כולל מחברים אלה, הציגו לאחרונה אורגנוידים במוח האנושי מודל הפרעות מיטוכונדריאליות. מאמר זה מדווח על פרוטוקול מפורט לדור החזק של אורגנוידים אנושיים שמקורם ב- IPSC והשימוש בהם בפרופילים ביו-אנרגטיים מיטוכונדריאליים וניתוחי הדמיה. ניסויים אלה יאפשרו שימוש באורגנוידים במוח כדי לחקור תפקודים מטבוליים והתפתחותיים ועשויים לספק מידע חיוני כדי לנתח את הפתולוגיה העצבית של מחלות מיטוכונדריאליות.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחלות מיטוכונדריאליות מייצגות את הכיתה הגדולה ביותר של טעויות מולדות של חילוף החומרים1. הם נגרמים על ידי מוטציות גנטיות המשבשות תהליכים מיטוכונדריאליים שונים, כולל זרחן חמצוני (OXPHOS)2, הרכבת שרשרת הנשימה, דינמיקה מיטוכונדריאלית, ותעתיק DNA מיטוכונדריאלי או שכפול3. רקמות עם דרישות אנרגיה מושפעים במיוחד על ידי תפקוד מיטוכונדריאלי4. בהתאם, חולים עם מחלות מיטוכונדריאליות בדרך כלל לפתח ביטויים נוירולוגיים מוקדמים.

אין כיום טיפולים זמינים לילדים הנגועים במחלות מיטוכונדריאליות5. מכשול מרכזי להתפתחות תרופות של מחלות מיטוכונדריאל....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: השימוש ב- IPSCs אנושי עשוי לדרוש אישור אתי. iPSCs בשימוש במחקר זה נגזרו מאנשים בקרה בריאה לאחר אישור אתי מקומי (#2019-681). כל נהלי תרבית התא חייבים להתבצע תחת מכסה המנוע של תרבית תאים סטרילית, בזהירות חיטוי כל ריאגנטים ומתכלים לפני המעבר מתחת למכסה המנוע. IPSCs אנושי המשמש לבידול צריך להיות מספר מעבר מתחת 50 כדי למנוע סטיות גנומיות פוטנציאליות שעלולות להתרחש על תרבות נרחבת. המצב pluripotent של התאים צריך להיות מאומת לפני יצירת organoid, למשל, על ידי ניטור הביטוי של סמנים הקשורים pluripotency כגון NANOG או OCT4. בדיקות Mycoplasma צריכות להתבצע כל שבוע כדי להבטיח תרבויות ללא מיקופלסמה.

1. דור האורגנוידים במוח

  1. תרבות של IPSCs א....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר את הדור החזק של organoids עגול (איור 1A). האורגנוידים שנוצרו מכילים נוירונים בוגרים שניתן לדמיין באמצעות סמני חלבון ספציפיים לאקסונים (SMI312) ודנדריטים (חלבון הקשור למיקרוטובול 2 (MAP2)) (איור 1B). אורגנוידים בוגרים מכילים לא רק תאים עצביים (MAP2-חיובי) אלא גם תאי גליה (למשל, חיוביים עבור סמן האסטרוציטים S100 חלבון מחייב סידן B (S100ß)) (איור 1B)<.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מאמר זה מתאר את הדור הניתב לשחזור של אורגנוידים אנושיים המופקים מ- IPSC ואת השימוש בהם למידול מחלות מיטוכונדריאליות. הפרוטוקול המתואר כאן משתנה בהתבסס על עבודה שפורסמה בעבר20. אחד היתרונות העיקריים של הפרוטוקול הנוכחי הוא שהוא אינו דורש הטמעה ידנית של כל אורגנויד במטריצה פיגומים. למעשה, פתרון המטריצה פשוט מומס למדיום תרבית התא. יתר על כן, אין צורך להעסיק bioreactors יקר, כמו organoids ניתן תרבית בתרבות רקמות סטנדרטית 6-היטב לוחות ממוקם על שייקר מסלולית בתוך האינקובטור. הליך זה מאפשר גם טיפוח מקביל.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אינם מצהירים על אינטרסים פיננסיים או לא פיננסיים מתחרים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים למרים בנינג על התמיכה הטכנית. אנו מכירים בתמיכה של דויטשה Forschungsgemeinschaft (DFG) (PR1527/5-1 ל- A.P.), ספארק ומכון הבריאות של ברלין (BIH) (קרנות אימות BIH ל- A.P.), הקרן המאוחדת למחלות מיטוכונדריאליות (UMDF) (מענק הקונסורציום הבינלאומי של תסמונת לי ל- A.P.), דיסלדורף של בית החולים האוניברסיטאי (Forschungskommission UKD ל- A.P.), ומשרד החינוך והמחקר הפדרלי הגרמני (BMBF) (ה: ביו חוקר צעיר להעניק AZ 031L0211 לא.פ.). העבודה במעבדה של C.R.R. נתמכה על ידי DFG (עבור 2795 "סינפסות תחת לחץ", Ro 2327/13-1).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
2-מרקפטואתנולGibco31350-010
Affinity DesignerSerif (אירופה) בע"מתוכנת פריסה; עורך גרפיקה וקטורית
Alexa Fluor 488 חמור אנטי שרקןסיגמא אולדריץ'SAB4600033-250UL1:300
Alexa Fluor 488 חמור נגד עכברThermo Fisher ScientificA-315711:300
Antimycin ASigma Aldrich1397-94-0
Anti-β-Tubulin III (TUJ-1)Sigma AldrichT85781:2000
לייזר ארגוןMelles Griotכל לייזר אחר, למשל, לייזרי דיודה הפולטים 488 זה בסדר, גם
חומצה אסקורביתSigmaA92902
B-27 עם ויטמין AGibco17504044
Bacto AgarBecton Dickinson3% ב-PBS, אחסן תמיסה ב-20 מעלות; C
BDNFMiltenyi Biotec130-093-0811
cAMPSigmaD0627
תרבית תא כוכב תא 6 צלחתבאר Greiner-Bio-One657160
תרכיז שומנים מוגדר כימיתGibco11905031
מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי C1פתרונות מיקרוסקופ ניקון מיקרוסקופמודולרי מערכת
קורנינג מטריג'ל גורם גדילה מופחת (GFR) מטריצת ממברנת בסיס, פנול ללא אדום, ללא LDEVרכיב 356231 מטריקסקורנינג
בדיקת התפשטות תאיםThermo FisherC7026
DMEM/F12ThermoFisher31330038
DMSOSigmaD2660-100ML
חמור נגד עזים Cy3Merck MilliporeAP180C1:300
חמור נגד עכבר Cy3Merck MilliporeAP192C1:300
חמור נגד ארנב Cy3Merck MilliporeAP182C1:300
DPBSGibco14190250
DS-Q1Mc מצלמהNikon Microscope Solutions
Eclipse 90i מיקרוסקופ שדה רחב זקוףניקון פתרונות מיקרוסקופ
Eclipse E 600FN מיקרוסקופ זקוףניקון פתרונות
Eclipse Ts2 מיקרוסקופ הפוךניקון פתרונות מיקרוסופ
EZ-C1 כסף גרסה 3.91ניקון פתרונותמיקרוסקופ הדמיה תוכנה למיקרוסקופ קונפוקלי
FCCPסיגמא אולדריץ'370-86-5
סרום בקר עובריGibco10270-106
GDNFMiltenyi Biotec130-096-291
גלזגו MEMGibco11710-035
פיפטה מזכוכית פסטרמותג747715
הפוך GlutamaxGibco35050-061
הליום-ניאוןלייזר Melles Griotכל לייזר שני, למשל, לייזרי דיודה הפולטים 594 זה בסדרגם
HeparinMerckH3149-25KU
HERACell 240i CO2 IncubatorThermo Scientific51026331
Hoechst 33342InvitrogenH35701:2500
Image J 1.53cWayne Rasband המכון הלאומי לבריאותתוכנה לעיבוד תמונה
Injekt Solo 10 מ"ל / LuerBraun4606108V
החלפת סרום נוקאאוטלייזר Gibco10828010
(407 ננומטר)קוהרנטיכל לייזר אחר, למשל, לייזרי דיודה הפולטים 407 זה בסדר, גם
Map2Synaptic SystemsNo. 1880041:1000
Maxisafe 2030i
MEM NEAAGibco11140-050
mTeSR Plusטכנולוגיית תאי גזע85850iPSC בינוני
Multifuge X3R צנטריפוגהתרמו מדעית10325804
MycoAlert ערכת זיהוי מיקופלזמהLonza# LT07-218
N2 תוסףGibco17502-048
מחט לשימוש חד פעמי (23G x 1 אינץ' TW)Neoject10016
NIS-Elements Aadvanced Research 3.2NikonImaging software
Oligomycin ASigma Aldrich75351
Orbital Shaker Heidolph Unimax 1010Heidolph543-12310-00
PAP PenSigmaZ377821-1EAכדי לצייר מחסום הידרופובי על מגלשות.
ערכת מערכת דיסוציאציה פפאיןוורת'ינגטוןLK003150
פרפורמלדהידMerck8187154% ב-PBS, תמיסת אחסון ב-20 מעלות; C
פסטר פיפטה 7 מ"לVWR612-1681מדורג עד 3 מ"ל
פניצילין-סטרפטומיציןGibco15140-122
Plan Apo VC 20x / 0.75 air DIC N2  ∞/0.17 WD 1.0Nikon MicroscopeSolutions תוכנית אובייקטיבית מיקרוסקופ
Apo VC 60x / 1.40 שמן DIC N2 ∞/0.17 WD 0.13פתרונותמיקרוסקופ של ניקוןשמן טבילה מיקרוסקופ אובייקטיבי
פוליסטירן צלחת פטרי (100 מ"מ)גריינר ביו-וואן664161
פוליסטירן צינור תחתון עגול עם מכסה מסננת תאים (5 מ"ל)פלקון352235
אשלגן כלוריRoth6781.1
ProLong זכוכית Antifade MoutantInvitrogenP36980
נייר סינון איכותיVWR516-0813
מעכב סלעיםMerckSCM075
רוטנוןסיגמא83-794
S100βAbcamAb111781:600
SB-431542Cayman Chemical Company13031
להבי אזמלHeinz Herenz Hamburq1110918
SMI312Biolegend837904 1:500
נתרן ביקרבונטMerck/Sigma31437-1kg-M
נתרןכלורי רוט3957
נתרן דימימן פוספטApplichem131965
נתרן פירובטGibco11360070
SOX2סנטה קרוז ביוטכנולוגיהSC-173201:100
StemPro Accutase Cell Dissociation ReagentGibco / StemProA1110501מגיב
ג'ל דבק סופר UHU63261ג'ל דבק
SuperFrost PlusVWR631-0108
מזרק לשימוש חד פעמי (1 מ"ל)BD פלסטיפאק300015
TB2 תרמובלוקביומטרה
צלחת TC 24 בארSarstedt83.3922
TC צלחת 6 בארSarstedt83.392
TGFbeta3Miltenyi Biotec130-094-007
קולט אדיםלתרבית רקמותThermoFisher51032711
TOM20Santa Cruz BiotechnologySC-114151:200
Triton-XMerckX100-5ML
UltraPure 0.5MEDTA Invitrogen15575020
Vibratome Microm HM 650 VThermo Scientificהייצור הסתיים, כל מיקרוטום מתכוונן אחר גם הוא בסדר.
Vibratome Wilkinson Classic Razor BladeWilkinson Sword70517470
Whatman BenchkoteMerck/Sigma28418852
Wnt אנטגוניסט IEMD Millipore Corp3378738
XF 96 מנתח שטף חוץ-תאיSeahorse Bioscience100737-101
XF Assay DMEM MediumSeahorse Bioscience103680-100
XF Calibrant SolutionSeahorse Bioscience100840-000
XFe96 FluxPak (96 בארות מיקרוSeahorse Bioscience102416-100
ערכת מיקרוסקופ יבש , )

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Koopman, W. J., Willems, P. H., Smeitink, J. A. Monogenic mitochondrial disorders. New England Journal of Medicine. 366 (12), 1132-1141 (2012).
  2. Gorman, G. S., et al. Mitochondrial diseases. Nature Review Disease Primers. 2, 16080(2016).
  3. Vafai, S. B., Mootha, V. K.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Brain OrganoidsMitochondrial DiseaseHuman iPSCsOrganoid GenerationCortical DifferentiationNeurosphere FormationBioenergetic ProfilingConfocal ImagingOxygen Consumption RateMitochondrial Metabolism

Related Articles