Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Генерация органоидов головного мозга человека для моделирования митохондриальных заболеваний

6.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/62756

⸱

21 июня 2021 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of General Pediatrics, Neonatology and Pediatric Cardiology, Duesseldorf University Hospital, Medical Faculty, Heinrich Heine University, 2Institute of Neurobiology, Heinrich Heine University, 3Berlin Institute for Medical Systems Biology (BIMSB), Max Delbrueck Center for Molecular Medicine (MDC), 4Seaver Autism Center for Research and Treatment, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 5Max Delbrueck Center for Molecular Medicine (MDC)

В этой статье

Краткое содержание

Мы описываем подробный протокол генерации индуцированных человеком плюрипотентных органоидов мозга, полученных из стволовых клеток, и их использование в моделировании митохондриальных заболеваний.

Аннотация

Митохондриальные заболевания представляют собой самый большой класс врожденных ошибок метаболизма и в настоящее время неизлечимы. Эти заболевания вызывают дефекты развития нервной системы, основные механизмы которых еще предстоит выяснить. Основным препятствием является отсутствие эффективных моделей, повторяющих раннее нарушение нейронов, наблюдаемое у пациентов. Достижения в технологии индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (IPSCs) позволяют генерировать трехмерные (3D) органоиды мозга, которые могут быть использованы для исследования влияния заболеваний на развитие и организацию нервной системы. Исследователи, в том числе эти авторы, недавно представили органоиды человеческого мозга для моделирования митохондриальных расстройств. В этой статье сообщается о подробном протоколе для надежной генерации органоидов головного мозга человека, полученных из iPSC, и их использовании в митохондриальном биоэнергетическом профилировании и анализе изображений. Эти эксперименты позволят использовать органоиды мозга для исследования метаболических дисфункций и дисфункций развития и могут предоставить важную информацию для препарирования нейронной патологии митохондриальных заболеваний.

Введение

Митохондриальные заболевания представляют собой самый большой класс врожденных ошибок метаболизма1. Они вызваны генетическими мутациями, нарушающими различные митохондриальные процессы, включая окислительное фосфорилирование (OXPHOS)2, сборку дыхательной цепи, митохондриальную динамику и транскрипцию или репликацию митохондриальной ДНК3. Ткани с энергетическими потребностями особенно страдают от митохондриальной дисфункции4. Соответственно, у пациентов с митохондриальными заболеваниями обычно развиваются ранние неврологические проявления.

В настоящее время нет доступных методов лечения для детей, страдающих митохондриальными заболеваниями5. Основным препятствием для разработки лекарств от митохондриальных заболеваний является отсутствие эффективных моделей, повторяющих течение болезни человека6. Некоторые из изученных в настоящее время животных моделей не демонстрируют неврологических дефектов, присутствующих у пациентов7. Следовательно, механизмы, лежащие в основе нейронной патологии митохондриальных заболеваний, до сих пор не до конца поняты.

Недавние исследования генерировали ИПСК у пациентов, страдающих митохондриальными заболеваниями, и использовали эти клетки для получения специфических для пациента нейрональных клеток. Например, было обнаружено, что генетические дефекты, связанные с митохондриальным заболеванием, синдромом Ли, вызывают аберрации в клеточной биоэнергетике8,9, синтезе белка10 и гомеостазе кальция9,11. Эти отчеты предоставили важные механистические подсказки о нарушениях нейронов, происходящих при митохондриальных заболеваниях, проложив путь к открытию лекарств для этих неизлечимых заболеваний12.

Двумерные (2D) культуры, однако, не позволяют исследовать архитектурную сложность и региональную организацию 3D-органов13. С этой целью использование 3D-органоидов мозга, полученных из специфических для пациента iPSCs14, может позволить исследователям получить дополнительную важную информацию и тем самым помочь проанализировать, как митохондриальные заболевания влияют на развитие и функцию нервной системы15. Исследования с использованием органоидов головного мозга, полученных из iPSC, для изучения митохондриальных заболеваний начинают раскрывать компоненты развития нервной системы митохондриальных заболеваний.

Органоиды спинного мозга, несущие мутации, связанные с митохондриальным заболеванием, митохондриальной энцефалопатией, лактоацидозом и синдромом инсультоподобных эпизодов (MELAS), показали дефектный нейрогенез и задержку дифференцировки двигательных нейронов16. Корковые органоиды, полученные от пациентов с митохондриальным заболеванием, синдромом Ли, показали уменьшенные размеры, дефекты генерации нервных эпителиальных почек и потерю корковой архитектуры17. Органоиды головного мозга у пациентов с синдромом Ли показали, что дефекты заболевания инициируются на уровне нейронных клеток-предшественников, которые не могут фиксировать митохондриальный метаболизм, вызывая аберрантное ветвление нейронов и морфогенез18. Таким образом, нейронные предшественники могут представлять собой клеточную терапевтическую мишень для митохондриальных заболеваний, а стратегии, способствующие их митохондриальной функции, могут поддерживать функциональное развитие нервной системы.

Использование органоидов мозга может помочь раскрыть компоненты нейроразвития митохондриальных заболеваний. Митохондриальные заболевания в основном рассматриваются как раннее начало нейродегенерации5. Однако дефекты развития нервной системы также присутствуют у пациентов, страдающих митохондриальными заболеваниями, включая задержку развития и когнитивные нарушения19. Органоиды мозга, специфичные для пациента, могут помочь решить эти аспекты и прояснить, как митохондриальные заболевания могут влиять на развитие мозга человека. Митохондриальная дисфункция может также играть патогенетическую роль в других более распространенных неврологических заболеваниях, таких как болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона и болезнь Хантингтона4. Следовательно, выяснение влияния митохондриальных дефектов на нервное развитие с использованием органоидов мозга также может сыграть важную роль в изучении этих заболеваний. В этой статье описывается подробный протокол генерации воспроизводимых органоидов головного мозга, которые могут быть использованы для проведения моделирования заболеваний митохондрий.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Использование человеческих ИПСК может потребовать этического одобрения. IPSCs, используемые в этом исследовании, были получены от здоровых контрольных лиц после местного этического одобрения (#2019-681). Все процедуры культивирования клеток должны выполняться под стерильным клеточным культиватором, тщательно дезинфицируя все реагенты и расходные материалы перед переносом под капот. Человеческие ИПСК, используемые для дифференциации, должны иметь число проходов ниже 50, чтобы избежать потенциальных геномных аберраций, которые могут возникнуть при обширной культуре. Плюрипотентное состояние клеток должно быть подтверждено до генерации органоидов, например, путем мониторинга экспрессии маркеров, связанных с плюрипотентностью, таких как NANOG или OCT4. Тесты на микоплазму следует проводить еженедельно, чтобы обеспечить культуры без микоплазмы.

1. Генерация органоидов головного мозга

  1. Культура человеческих ИПСК
    1. Культивируйте человеческие ИПСК в условиях, свободных от кормителей, в среде iPSC (см. Таблицу материалов) на покрытых 6-луночными пластинами и храните их в инкубаторе культуры увлажненных тканей при 37 °C и 5% CO2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перенос питательных клеток может препятствовать дифференцировке органоидов. Прохождение клеток по крайней мере один раз в условиях, свободных от кормушки.
    2. Проходят иПСК при 80% слиянии с использованием безферментной отслойной среды в соотношениях от 1:4 до 1:12. Чтобы увеличить выживаемость клеток, добавляют 10 мкМ Rho-ассоциированного ингибитора протеинкиназы (ROCK) (Y27632) после каждого расщепления.
  2. Диссоциация iPSCs (80% слияния) - День 0.
    1. Готовят кортикальную дифференцировочную среду I (CDMI) (табл. 1). Передогреваемую среду CDMI при комнатной температуре (22-25 °C) перед добавлением ее в ячейки.
    2. Промывайте колодцы, содержащие ИПСК, фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS) для удаления мертвых клеток и мусора.
    3. Добавьте 500 мкл предварительно расплавленного реагента А (Таблица материалов) в каждую лунку и инкубируйте в течение 5 мин при 37 °C. Проверьте под микроскопом, чтобы убедиться в отсоединении клеток.
    4. Добавляют 1 мл среды iPSC для разбавления реагента А для нейтрализации его активности.
    5. Используйте пипетку объемом 1000 мкл для диссоциации клеток путем пипетирования вверх и вниз и переноса клеточной суспензии в трубку центрифуги объемом 15 мл.
    6. Осторожно центрифугируйте иПСК при 125 х г в течение 5 мин при комнатной температуре (22-25 °C).
    7. Осторожно аспирируйте супернатант, чтобы не нарушить клеточную гранулу.
    8. Повторно суспендируйте гранулу с 1 мл CDMI для получения одноклеточной суспензии и подсчитайте номер ячейки.
    9. Готовят посевную среду с 9000 иПСК на 100 мкл в CDMI, дополненную ингибитором ROCK 20 мкМ, ингибитором WNT-катенина 3 мкМ (IWR1) и 5 мкМ SB431542.
    10. Добавьте 100 мкл посевной среды на скважину к пластине с v-образным дном из 96 лунок.
    11. Храните пластину в инкубаторе культуры увлажненной ткани при 37 °C и 5% CO2.
  3. Генерация нейросферы
    1. На 1-й день наблюдайте, что формируются круглые клеточные агрегаты (невросферы) с определенными гладкими границами. Обратите внимание на мертвые клетки вокруг агрегатов. Продолжают культивировать в инкубаторе при 37 °C и 5% CO2.
    2. На 3-й день перемешайте тарелку, постукивая по бокам три раза, чтобы отделить мертвые клетки.
    3. Добавьте 100 мкл CDMI, дополненного ингибитором ROCK 20 мкМ, 3 мкМ IWR1 и 5 мкМ SB431542 к каждой лунке.
    4. Верните пластину в инкубатор при 37 °C и 5% CO2.
    5. На 6 день осторожно удалите 80 мкл надопоставленной среды из каждой лунки. Избегайте прикосновения к дну колодца.
    6. Добавьте 100 мкл CDMI с добавлением 3 мкМ IWR1 и 5 мкМ SB431542 в каждую лунку. Верните пластину в инкубатор при 37 °C и 5% CO2.
    7. Повторяйте шаги 5 и 6 каждые 3 дня до 18 дня.
  4. Перенос невросфер
    1. На 18-й день подготовьте кортикальную дифференцировочную среду II (CDMII) (таблица 1) и добавьте 10 мл в 100 мм ультранизкую пластину для культивирования клеток.
    2. Используйте пипетку объемом 200 мкл с отрезанным наконечником, чтобы перенести круглые невросферы с 96-луночной пластины на 100-миллиметровую пластину для культивирования клеток со сверхнизким прикреплением.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы избежать повреждения невросфер, убедившись, что отверстие наконечника достаточно широкое и что агрегаты не аспирируются слишком быстро.
    3. Удалите 5 мл среды из пластины, содержащей невросферы, и добавьте 5 мл свежего CDMII.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура помогает уменьшить количество среды CDMI, которая, возможно, перешла от переноса невросфер.
    4. Поместите пластину на орбитальный шейкер со скоростью 70 об/мин внутри инкубатора культуры увлажненной ткани при 37 °C и 5% CO2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Визуально осмотрите невросферы на следующий день. Увеличьте скорость орбитального шейкера, если невросферы слипнуты вместе или прикреплены к нижней части пластины.
    5. Каждые 3 дня тщательно аспирируйте надосадочную среду и заменяйте ее свежим CDMII. Оставьте небольшое количество среды, чтобы предотвратить высыхание невросфер.
    6. На 35-й день готовят кортикальную дифференцировочную среду III (CDMIII) (таблица 1).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Компонент матрицы должен быть растворен в холодном CDMIII.
    7. Аспирируйте среду из пластины и добавьте 10 мл холодного CDMIII.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Более эффективно использовать холодную среду, чтобы компонент матрицы мог покрывать органоиды, не образуя сгустков.
    8. После изменения среды поместите пластину обратно на орбитальный шейкер при 70 об/мин внутри инкубатора культуры увлажненной ткани при 37 °C и 5% CO2.
    9. Меняйте среду каждые 3-5 дней в зависимости от скорости роста, на что указывает цвет среды.
    10. На 70-й день готовят кортикальную дифференцировочную среду IV (CDMIV) (таблица 1). Используйте среду CDMIV до тех пор, пока не будет достигнут желаемый возраст органоидов. В течение этого периода держите пластину на орбитальном шейкере, установленном при 70 оборотах в минуту внутри инкубатора культуры увлажненной ткани (37 ° C и 5% CO2).
    11. Меняйте среду каждые 3-5 дней, в зависимости от скорости роста.

2. Иммуноокрашивание органоидов головного мозга

  1. Подготовка тканей
    1. Приготовьте 4% раствор параформальдегида (PFA) и поместите его под защитную оболочку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Носите средства индивидуальной безопасности при работе с PFA.
    2. Соберите органоиды мозга и аккуратно перенесите их с помощью пластиковой пипетки Пастера с тупым наконечником 3 мл на 6-луночную пластину, заполненную PFA.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте органоиды старше 40 дней, чтобы обеспечить визуализацию структур с более высокой клеточной сложностью.
    3. Выдерживают органоиды в растворе PFA в течение 1 ч при комнатной температуре.
    4. Осторожно удалите PFA пластиковой пипеткой Пастера объемом 3 мл и трижды вымойте неподвижные органоиды с помощью PBS.
    5. Храните фиксированные органоиды при температуре 4 °C в PBS до дальнейшего использования.
  2. Приготовление органоидных срезов головного мозга
    1. Приготовьте 3% раствор агара и медленно нагревайте до разжижения.
    2. Поместите форму (вырезанный конец шприца объемом 10 мл) на кусок абсорбирующей фильтровальной бумаги (гладкая сторона вверх). Поместите на него каплю агара.
    3. Быстро достаньте один органоид из 6-луночной пластины шпателем и удалите лишний PBS фильтровальной бумагой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не касаться органоида непосредственно фильтровальной бумагой.
    4. Поместите органоид на каплю агара.
    5. Повторите эту процедуру с тремя органоидами.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Работайте быстро, чтобы избежать затвердевания агара на этом этапе.
    6. Заправляйте форму агаром до тех пор, пока все органоиды не будут полностью покрыты.
    7. Подождите, пока агар начнет затвердевать, а затем аккуратно перенесите всю форму, содержащую органоиды, включая абсорбирующую фильтровальную бумагу, на охлаждающий элемент.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если охлаждающий элемент недоступен, храните органоиды в течение нескольких минут в холодильнике при температуре 4 °C.
    8. А пока подготовьтесь к процедуре нарезки: поместите лезвие бритвы (очищенное ацетоном и промытое двойной дистиллированной водой) в держатель вибратома, установите на ванну и наполните его PBS.
    9. Удалите плесень из (затвердевшего) агара и используйте скальпель, чтобы обрезать его, чтобы сформировать куб.
    10. Прикрепите куб агара, содержащий органоиды, к несущей пластине вибратома с помощью адгезивного геля (см. Таблицу материалов) и поместите его в ванну, содержащую PBS.
    11. Отрегулируйте вибратом (см. Таблицу материалов) для резки срезов толщиной 150 мкм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Настройки вибратома (правильный угол, амплитуда, частота и скорость лезвия) могут быть аналогичны тем, которые используются для нарезки фиксированной мозговой ткани, полученной от ранних постнатальных животных. Тем не менее, идеальные настройки сильно зависят от типа вибратома и должны быть определены на первом этапе, чтобы предотвратить искажение или даже разрыв ткани во время разреза.
    12. Начните процедуру резки. Используйте стеклянную пипетку или шпатель, чтобы аккуратно перенести каждый свеженарезанный кусочек в 24-луночную тарелку, наполненную PBS.
    13. Храните пластину, содержащую ломтики, при 4 °C (до нескольких дней) до дальнейшей обработки.
    14. Переложите кусочки из тарелки стеклянной пипеткой или шпателем на предметные стекла микроскопа. Используйте не менее 2 фрагментов на слайд.
    15. Аккуратно удалите агар и излишки ПБС шприцем.
    16. Дайте ломтикам высохнуть, пока они не прилипнут к слайдам.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя предметные стекла микроскопа можно хранить в пластиковых камерах, заполненных PBS при 4 °C, они должны быть окрашены как можно скорее после процедуры нарезки.
  3. Иммуногистохимическое окрашивание
    1. Подготовьте блокирующий раствор (табл. 1).
    2. Используйте ручку PAP, чтобы нарисовать гидрофобную границу вокруг срезов на слайде, чтобы сохранить все решения на слайдах.
    3. Осторожно добавляют блокирующий раствор на горку, и инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре (22-25 °С). Чтобы избежать разрушения ткани, не добавляйте раствор непосредственно поверх ломтиков.
    4. Аспирировать блокирующий раствор и применять желаемое первичное антитело, разведенное в блокирующем растворе.
    5. Инкубируйте горку в течение ночи в увлажненной камере при 4 °C.
    6. Промойте слайд три раза с 1x PBS в течение 10 минут каждый.
    7. Инкубируют срезы со специфическим вторичным антителом, разведенным в блокирующем растворе, и выполняют окрашивание Hoechst (1:2,500) в течение 1 ч при комнатной температуре в темноте.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не забудьте выполнить отрицательные элементы управления, чтобы подтвердить, что нет неспецифического связывания или автофлуоресценции.
    8. Смойте три раза 1x PBS в течение 10 минут каждый в темноте.
    9. Добавьте одну каплю монтажной среды к срезу, поместите крышку на край капли и медленно положите крышку вниз к срезу, чтобы избежать пузырьков воздуха.
    10. Дайте слайду отдохнуть ночью при комнатной температуре. Нанесите лак для ногтей на границу обшивки, чтобы еще больше запечатать слайд. Для длительного хранения хранить при температуре 4 °C.
  4. Документация по окрашиванию
    1. Для сканирования больших изображений на предмет сшивания используйте моторизованный вертикальный широкоугольный микроскоп, оснащенный (см. Таблицу материалов для деталей) высококачественным объективом; Набор фильтров DAPI (например, возбуждение (EX): 340-380 нм, дихроичное зеркало (DM): 400 нм, барьерный фильтр (BA): 435-485 нм); набор флуоресцеиновых изотиоцианатных фильтров (например, EX: 465-495 нм, DM: 505 нм, BA: 515-555 нм); Набор фильтров Alexa594 (например, ET 575/40; T 600 LPXR; HC 623/24); цифровой фотоаппарат; высокопроизводительное программное обеспечение для сбора, позволяющее автоматизировать стежки и стековые операции.
    2. Для обработки изображений используйте программу обработки изображений, способную генерировать 8-битные tif-файлы, обрезать стежки, регулировать контрастность и яркость, объединять каналы (например, синий, зеленый и красный) и добавлять шкалы масштаба.
    3. Для сканирования деталей используйте моторизованный конфокальный лазерный сканирующий микроскоп, оснащенный высококачественным объективом, УФ-лазер (EX: 408 нм), аргоновый лазер (EX: 488 нм), гелий-неоновый лазер (EX: 543), программное обеспечение для визуализации для конфокального микроскопа.
    4. Для обработки деталей изображения используйте программу обработки изображений, способную генерировать проекции максимальной интенсивности конфокальных z-стеков (например, оптических секций по 0,6 мкм каждый), генерировать 8-битные tif-файлы, регулировать контрастность и яркость, объединять каналы (например, синий, зеленый и красный), добавлять шкалы масштаба.
    5. Используйте графический редактор для упорядочения фигур.

3. Биоэнергетическое профилирование органоидов головного мозга

  1. Подготовка органоидов для биоэнергетического профилирования
    1. Подготовьте раствор папаина и ДНКазы в соответствии с протоколом производителя.
    2. Переведите 3-5 органоидов в 6-луночную пластину. Вымойте их два раза с помощью предварительно расплавленного PBS.
    3. Добавьте 2 мл предварительно расплавленного активированного раствора папаина, содержащего ДНКазу. С помощью лезвия разрежьте органоиды на мелкие кусочки.
    4. Поместите пластину на орбитальный шейкер, установленный при 27 об/мин внутри инкубатора клеточной культуры (при 37 °C, 5% CO2), и инкубируйте в течение 15-20 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Время инкубации зависит от органоидной стадии. Органоиды ранней стадии могут быть использованы такими, какие они есть. Для органоидов старше 3 месяцев рекомендуется разрезать органоиды на 2-3 части перед диссоциацией и инкубировать кусочки со скоростью раскачивания, установленной при 27 об/мин в течение 15-20 мин при 37 °C. Эта процедура может помочь удалить некротическую ткань, которая может присутствовать в органоидах более поздней стадии.
    5. Соберите переваренные ткани в пробирку объемом 15 мл и добавьте 5 мл органоидной культуральной среды CDMIV (таблица 1).
    6. Тритурируйте ткань пластиковой пипеткой объемом 10 мл, пипеткой вверх и вниз 10-15 раз. Дайте недиссоциированной ткани осесть на дно трубки.
    7. Осторожно перенесите клеточную суспензию в пробирку объемом 15 мл, избегая любых кусочков недиссоциированной ткани. Отфильтруйте раствор через 40-мкм клеточный сетчатый фильтр (например, полистирольные трубки круглого дна с крышками клеточного сетчатого фильтра).
    8. Гранулируют ячейки центрифугированием при 300 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.
    9. Оцените количество и качество клеток с помощью трипан-синего цвета.
    10. Нанесите желаемое количество (~20 000/лунка) ячеек на покрытые 96-луночными микропластинами. Изменение среды через 6-8 ч после нанесения покрытия на нейронную среду (табл. 1).
    11. Инкубировать микропластину с покрытием из 96 лунок в CO2-инкубаторе (37 °C, 5% CO2) в течение 4 дней.
  2. Биоэнергетическое профилирование
    1. На 3-й день после повторного покрытия диссоциированных клеток добавьте 200 мкл калибровочного раствора в каждую лунку нижней части 96-луночной микропластины и поместите верхний зеленый картридж датчика на гидратированную микропластину.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поместите картридж датчика поверх микропластины в правильной ориентации и убедитесь, что калибрант покрывает все датчики.
    2. Инкубируйте гидратированную 96-луночную микропластину в инкубаторе без CO2 при 37 °C в течение ночи.
    3. Включите анализатор, чтобы прибор стабилизировался при 37 °C в течение ночи.
    4. На 4-й день после повторного покрытия осмотрите диссоциированную органоидную культуру на 96-луночной микропластине под микроскопом, чтобы убедиться, что клетки выглядят как сливающийся монослой.
    5. Подготовьте пробирную среду (табл. 1).
    6. Удалите нейронную среду из всех лунок с помощью пипетки, не касаясь дна лунки, чтобы предотвратить повреждение клеток. Кроме того, осторожно переверните всю пластину, а затем высушите ее на чистой бумаге. Работайте быстро, чтобы избежать гибели клеток.
    7. Дважды промыть клетки предварительно расплавленным 200 мкл пробирной среды. Добавьте пробирную среду к конечному объему 180 мкл на скважину. Инкубируйте 96-луночную микропластину в инкубаторе без CO2 при 37 °C в течение 1 ч.
    8. Готовят 10 мкМ растворов митохондриальных ингибиторов в пробирной среде. Отметим, что конечная концентрация после инъекции составляет 1 мкМ.
    9. Загрузите картридж датчика, помещенный в гидратированную микропластинку, 10-кратными растворами митохондриальных ингибиторов.
      1. Добавьте 18 мкл митохондриального ингибитора 1 в порт А.
      2. Добавьте 19,8 мкл митохондриального ингибитора 2 в порт B.
      3. Добавьте 21,6 мкл митохондриального ингибитора 2 в порт С.
      4. Добавьте 23,4 мкл митохондриального ингибитора 3 в порт D.
    10. Поместите заряженный картридж в гидратированную микропластинку в инкубаторе без CO2 при температуре 37 °C до начала анализа.
    11. Настройте работающий протокол в программном обеспечении прибора (таблица 2).
    12. Нажмите кнопку СТАРТ. Возьмите заряженный картридж из инкубатора без CO2 и поместите его в анализатор для калибровки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что пластина вставлена в правильной ориентации и без крышки.
    13. Как только этап калибровки закончится, снимите калибровочную пластину. Возьмите 96-луночную микропластину из инкубатора без CO2 и поместите ее в анализатор. Нажмите ПРОДОЛЖИТЬ , чтобы начать измерения.
    14. Когда пробег будет завершен, извлеките микропластину 96-луночной клеточной культуры из анализатора и соберите среду из всех лунок, не нарушая клетки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Среда может храниться при -20 °C и использоваться позже для измерения количества лактата, высвобождаемого клетками в среде, с использованием соответствующего набора для анализа лактата.
    15. Промывайте ячейки 200 мкл 1x PBS в каждой лунке.
    16. После удаления PBS заморозьте пластину при -20 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Замороженная пластина может быть использована для количественной оценки клеток, белков или ДНК в каждой лунке микропластины. Эта количественная оценка понадобится для нормализации полученных биоэнергетических норм. Следуйте инструкциям производителя для количественных анализов клеток, белков или ДНК.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Протокол, описанный здесь, облегчает надежную генерацию круглых органоидов (рисунок 1A). Генерируемые органоиды содержат зрелые нейроны, которые можно визуализировать с помощью белковых маркеров, специфичных для аксонов (SMI312) и дендритов (микротрубоче-ассоциированный белок 2 (MAP2)) (Рисунок 1B). Зрелые органоиды содержат не только нейронные клетки (MAP2-положительные), но и глиальные клетки (например, положи...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В этой статье описывается воспроизводимая генерация органоидов головного мозга человека, полученных из iPSC, и их использование для моделирования митохондриальных заболеваний. Протокол, описанный здесь, модифицирован на основе ранее опубликованной работы20. Одним из основных преимуществ настоящего протокола является то, что он не требует ручного встраивания каждого органоида в матрицу строительных лесов. По сути, матричный раствор просто растворяется в клеточной культуральной среде. Кроме того, не...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых или нефинансовых интересов.

Благодарности

Благодарим Мириам Бюннинг за техническую поддержку. Мы признаем поддержку со стороны Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) (PR1527/5-1 to A.P.), Spark и Берлинского института здравоохранения (BIH) (BIH Validation Funds to A.P.), Объединенного фонда митохондриальных заболеваний (UMDF) (грант Международного консорциума синдрома Ли для A.P.), Университетской больницы Дюссельдорфа (Forschungskommission UKD to A.P.) и Федерального министерства образования и исследований Германии (BMBF) (e: Грант био молодого исследователя AZ 031L0211 для A.P.). Работа в лаборатории C.R.R. была поддержана DFG (ЗА 2795 «Синапсы в состоянии стресса», Ro 2327/13-1).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
2-меркаптоэтанолGibco31350-010
Affinity DesignerSerif (Europe) LtdПрограммное обеспечение для верстки; Редактор векторной графики
Alexa Fluor 488 осел анти-морская свинкаSigma AldrichSAB4600033-250UL1:300
Alexa Fluor 488 осел анти-мышьThermo Fisher ScientificA-315711:300
Антимицин АSigma Aldrich1397-94-0
Анти-&бета;-тубулин III (TUJ-1)Sigma AldrichT85781:2000
Аргоновый лазерМеллес ГриотЛюбой другой лазер, например, диодные лазеры, излучающие 488, тоже
Аскорбиновая кислотаSigmaA92902
B-27 с витамином АGibco17504044
Bacto AgarBecton Dickinson3% в PBS, хранить раствор при -20 °°; C
BDNFMiltenyi Biotec130-093-0811
cAMPSigmaD0627
Клетка Звездная клеточная культура 6-луночный планшетGreiner-Bio-One657160
Химически определенный липидный концентратGibco11905031
Конфокальный лазерный сканирующий микроскоп C1Микроскоп Nikon РешенияМодульный конфокальный микроскоп система
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Матрица базальной мембраны, фенол без красного, без LDEVCorning356231Компонент матрицы
CyQUANT Набор для анализа пролиферации клетокThermo FisherC7026
DMEM/F12ThermoFisher31330038
DMSO SigmaD2660-100ML
Donkey Anti-goat Cy3Merck MilliporeAP180C1:300
Donkey anti-mouse Cy3Merck MilliporeAP192C1:300
Donkey anti-rabbit Cy3Merck MilliporeAP182C1:300
DPBSGibco14190250
DS-Q1Mc фотоаппаратNikon Microscope Решения
Eclipse 90i вертикальный широкопольный микроскопNikon Microscope Solutions
Вертикальный микроскоп Eclipse E 600FNРешения для микроскопов Nikon Eclipse
Ts2 Инвертированный микроскопNikon Microsope Solutions
EZ-C1 Silver Version 3.91РешенияПрограммное обеспечение для визуализации для конфокального микроскопа
FCCPSigma Aldrich370-86-5
Сыворотка для плода крупного рогатого скотаGibco10270-106
GDNFMiltenyi Biotec130-096-291
Glasgow MEMGibco11710-035
Стеклянный пипетка ПастераБренд747715инвертированный
глутамаксGibco35050-061
Гелий-неоновый лазерMelles GriotЛюбой второй лазер, например, диодные лазеры, излучающие 594 - это хорошо, too
HeparinMerckH3149-25KU
HERACell 240i CO2 IncubatorThermo Scientific51026331
Hoechst 33342InvitrogenH35701:2500
Image J 1.53cWayne Rasband National Institute of HealthПрограммное обеспечение для обработки изображений
Injekt Solo 10 mL/ LuerBraun4606108V
Замена нокаутирующей сывороткиGibco10828010
лазер (407 нм)КогерентныйЛюбой другой лазер, например, диодные лазеры, излучающие 407, тоже подойдут
Map2Synaptic SystemsNo. 1880041:1000
Maxisafe 2030i
MEM NEAAGibco11140-050
mTeSR PlusТехнология стволовых клеток85850iPSC medium
Multifuge X3R CentrifugeThermo Scientific10325804
MycoAlert Набор для обнаружения микоплазмыLonza# LT07-218
N2 SupplementGibco17502-048
Игла для одноразового использования (23G x 1" TW)Neoject10016
NIS-Elements Aadvanced Research 3.2Программное обеспечение для обработки изображенийNikon
Олигомицин АSigma Aldrich75351
Орбитальный шейкер Heidolph Unimax 1010Heidolph543-12310-00
PAP PenSigma Z377821-1EAДля рисования гидрофобного барьера на предметных стеклах.
Набор системы диссоциации папаинаWorthingtonLK003150
параформальдегидаMerck8187154% в PBS, хранить раствор при -20 °° C
Пипетка Пастера 7mLVWR612-1681Градуирована до 3 мл
Пенициллин-стрептомицинGibco15140-122
План Apo VC 20x / 0.75 air DIC N2  ∞/0.17 WD 1.0Nikon Microscope SolutionsСухой микроскоп
Объектив План Apo VC 60x / 1.40 масло DIC N2 ∞/0.17 WD 0.13Nikon Microscope SolutionsМасляный иммерсионный микроскоп Объектив
Чашка Петри из полистирола (100 мм)Greiner Bio-One664161
Трубка из полистирола с круглым дном и крышкой из фильтра (5 мл)Falcon352235
хлорид калияRoth6781.1
ProLong Glass Antifade Moutant MoutantInvitrogenP36980
Качественная фильтровальная бумагаVWR516-0813
Ингибитор горных породMerckSCM075
RotenoneSigma83-794
S100βAbcamAb111781:600
SB-431542Cayman Chemical Company13031
Лезвия скальпеляHeinz Herenz Hamburq1110918
SMI312Biolegend8379041:500
Бикарбонат натрияMerck/Sigma31437-1кг-M
Хлорид натрияRoth3957
Натрий дигидрофосфатАпплименем131965
пируват натрияGibco11360070
SOX2Santa Cruz BiotechnologySc-173201:100
StemPro Accutase Реагент для диссоциации клетокGibco/StemProA1110501Реагент A
Super Glue GelUHU63261Адгезивный гель
SuperFrost PlusVWR631-0108
Шприц для одноразового использования (1 мл)BD Plastipak300015
TB2 ThermoblockBiometra
TC Plate 24 WellSarstedt83.3922
TC Plate 6 WellSarstedt83.392
TGFbeta3Miltenyi Biotec130-094-007
Капюшондля культуры тканейThermoFisher51032711
TOM20Santa Cruz BiotechnologySC-114151:200
Triton-XMerckX100-5ML
UltraPure 0.5M EDTAInvitrogen15575020
Vibratome Microm HM 650 VThermo ScientificПроизводство прекращено, любой другой регулируемый микротом тоже подойдет.
Vibratome Wilkinson Classic Razor BladeWilkinson Sword70517470
Whatman BenchkoteMerck/Sigma28418852
Wnt антагонист IEMD Millipore Corp3378738
XF 96 анализатор внеклеточного потокаSeahorse Bioscience100737-101
XF Assay DMEM MediumSeahorse Bioscience103680-100
XF Calibrant SolutionSeahorse Bioscience100840-000
XFe96 FluxPak (96-луночный микропланшет)Seahorse Bioscience102416-100
для микроскопа для микроскопов Nikon

Ссылки

  1. Koopman, W. J., Willems, P. H., Smeitink, J. A. Monogenic mitochondrial disorders. New England Journal of Medicine. 366 (12), 1132-1141 (2012).
  2. Gorman, G. S., et al. Mitochondrial diseases. Nature Review Disease Primers. 2, 16080(2016).
  3. Vafai, S. B., Mootha, V. K. Mitochondrial disorders as windows into an ancient organelle. Nature. 491 (7424), 374-383 (2012).
  4. Carelli, V., Chan, D. C. Mitochondrial DNA: impacting central and peripheral nervous systems. Neuron. 84 (6), 1126-1142 (2014).
  5. Russell, O. M., Gorman, G. S., Lightowlers, R. N., Turnbull, D. M. Mitochondrial diseases: hope for the future. Cell. 181 (1), 168-188 (2020).
  6. Weissig, V. Drug development for the therapy of mitochondrial diseases. Trends in Molecular Medicine. 26 (1), 40-57 (2020).
  7. Tyynismaa, H., Suomalainen, A. Mouse models of mitochondrial DNA defects and their relevance for human disease. EMBO Reports. 10 (2), 137-143 (2009).
  8. Ma, H., et al. Metabolic rescue in pluripotent cells from patients with mtDNA disease. Nature. 524 (7564), 234-238 (2015).
  9. Galera-Monge, T., et al. Mitochondrial dysfunction and calcium dysregulation in Leigh syndrome induced pluripotent stem cell derived neurons. International Journal of Molecular Science. 21 (9), 3191(2020).
  10. Zheng, X., et al. Alleviation of neuronal energy deficiency by mTOR inhibition as a treatment for mitochondria-related neurodegeneration. Elife. 5, 13378(2016).
  11. Lorenz, C., et al. Human iPSC-derived neural progenitors are an effective drug discovery model for neurological mtDNA disorders. Cell Stem Cell. 20 (5), 659-674 (2017).
  12. Inak, G., et al. Concise review: induced pluripotent stem cell-based drug discovery for mitochondrial disease. Stem Cells. 35 (7), 1655-1662 (2017).
  13. Chiaradia, I., Lancaster, M. A. Brain organoids for the study of human neurobiology at the interface of in vitro and in vivo. Nature Neuroscience. 23 (12), 1496-1508 (2020).
  14. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocol. 9 (10), 2329-2340 (2014).
  15. Liput, M., et al. Tools and approaches for analyzing the role of mitochondria in health, development and disease using human cerebral organoids. Developmental Neurobiology. , (2021).
  16. Winanto, K. Z. J., Soh, B. S., Fan, Y., Ng, S. Y. Organoid cultures of MELAS neural cells reveal hyperactive Notch signaling that impacts neurodevelopment. Cell Death and Disease. 11 (3), 182(2020).
  17. Romero-Morales, A. I., et al. Human iPSC-derived cerebral organoids model features of Leigh Syndrome and reveal abnormal corticogenesis. bioRxiv. , (2020).
  18. Inak, G., et al. Defective metabolic programming impairs early neuronal morphogenesis in neural cultures and an organoid model of Leigh syndrome. Nature Communications. 12 (1), 1929(2021).
  19. Falk, M. J. Neurodevelopmental manifestations of mitochondrial disease. Journal of Developmental & Behavioral Pediatrics. 31 (7), 610-621 (2010).
  20. Velasco, S., et al. Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex. Nature. 570 (7762), 523-527 (2019).
  21. Pfiffer, V., Prigione, A. Assessing the bioenergetic profile of human pluripotent stem cells. Methods in Molecular Biology. 1264, 279-288 (2015).
  22. Ludikhuize, M. C., Meerlo, M., Burgering, B. M. T., Colman, R. M. J. Protocol to profile the bioenergetics of organoids using Seahorse. STAR Protocols. 2 (1), 100386(2021).
  23. Menacho, C., Prigione, A. Tackling mitochondrial diversity in brain function: from animal models to human brain organoids. International Journal of Biochemestry & Cell Biology. 123, 105760(2020).
  24. Del Dosso, A., Urenda, J. P., Nguyen, T., Quadrato, G. Upgrading the physiological relevance of human brain organoids. Neuron. 107 (6), 1014-1028 (2020).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) человекагенерация органоидовкортикальная дифференцировкаформирование нейросфербиоэнергетическое профилированиеконфокальная визуализацияскорость потребления кислородамитохондриальный метаболизм
Генерация органоидов головного мозга человека для моделирования митохондриальных заболеваний
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.