이 원고는 단일 입자 극저온 전자 현미경 검사법을 위해 생물학적 표본을 수동으로 동결하는 블롯 앤 플런지 방법을 설명합니다.
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방법 논문
단일 입자 극저온 전자 현미경 검사법을 위한 생물학적 표본의 수동 블롯 및 플런지 동결
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이 논문에서
요약
초록
단일 입자 극저온 전자 현미경 검사법(cryoEM)에 의한 고해상도 구조 측정을 위해 전자를 사용한 이미징 생물학적 표본은 관심있는 생체 분자를 포함하는 유리체 얼음의 얇은 층을 필요로한다. 구조 생물학의 최전선에 단일 입자 극저온을 추진 한 최근 몇 년 동안 수많은 기술 진보에도 불구하고, 표본이 고해상도 이미징을 위해 유리화되는 방법은 종종 속도 제한 단계로 남아 있습니다. 최근 수많은 노력이 새로운 샘플 지원 및 혁신적인 유리화 계측의 개발을 포함하여 표본 병보 시 자주 발생하는 장애물을 극복하는 수단을 제공했지만, 기존의 수동으로 작동하는 플런서는 구매 비용과 운영 편의성으로 인해 냉동 EM 커뮤니티의 필수품으로 남아 있습니다. 여기서, 우리는 단일 입자 극저온에 의한 고해상도 이미징을 위한 생물학적 표본의 진동을 위해 표준, 기로틴 스타일의 수동으로 작동하는 블롯 및 플런지 장치를 사용하기위한 상세한 방법을 제공합니다. 또한 표준 준비가 적합한 시편을 산출하지 못하는 경우 일반적으로 발생하는 문제와 문제 해결 권장 사항도 설명되어 있습니다.
서론
단일 입자 극저온 전자 현미경 검사법(cryoEM)은 동적 생물학적 표본의 구조를 거의 원자 분해능1,2,3,4로 해결하는 데 사용할 수 있는 강력한 구조 기술입니다. 실제로, 최근 직전자 검출기 기술의 발전4,5,6,7,8,9,10, 전자 소스의 개선4,11,12,13,14, 전자기 렌즈 안정성
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프로토콜
1. 수동 급락 환경 준비
참고: 예상 작동 시간: 5-30분
- 가습기가 공동 배치될 수 있는 4°C 콜드룸에서 수동 플런저를 찾아 100% 상대 습도(RH) (도 1A)에 가깝게 방을 유지한다.
주의: 수동 플런저 및 권장 작업의 안전한 위치에 대한 기관의 환경 보건 및 안전 지침에 문의하십시오. - 그리드 준비 에 앞서, 차가운 방의 RH가 95 %≥ 보장하기 위해 차가운 방에서 가습기를 켭니다.
참고: 습도가 낮은 그리드 준비는 박막의 탈수, 증발로 인한 완충 부품의 변경, 그리드-그리드-그리드 재현성의 감소를 초래할 수 있습니다. <80 % RH에서 그리드를 동결하지 않는 것이 좋습니다. - 차가운 방의 온도가 4 °C에 있는지 확인하십시오.
- 그리드 근처의 난기류 및/또는 차가운 표면에 눈에 띄는 얼음 축적으로 이어질 수 있는 강력한 공기 전류(예: 에어컨 장치 통풍구에서 멀리 떨어진)에서 수동 플런저를 찾습니다.
2. 급락 재료 및 액세서리를 준비
참고: 예상 ....
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결과
여기에 설명된 블롯 및 플런지 프로토콜의 성공적인 실행은 전자 현미경하에서 관찰될 수 있는 어떤 육각형 얼음, 오염 물질 및 큰 그라데이션이 없는 얇고 균일한 유리체 얼음층을 초래할 것이다(그림 3). 그리드 표면과 블로팅 용지의 일관되지 않은 접촉, 블로팅 용지를 조기에 제거하거나 그리드 접촉 중에 블로팅 용지를 이동하면 유리체 얼음의 품질을 저하시키고 EM 그리드 전체의 일관되지 않은 얼음 두께로 이어질 수 있습니다(그림 4)
그림 1: 표본 급락 실 및 필수 장비. A) 이 문서.......
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토론
단일 입자 극저온 전자 현미경 검사법(cryoEM)에 의한 이미징을 위한 생물학적 표본의 진동은 성공적인 구조 결정에 매우 중요한 단계로 남아 있습니다. 이 프로토콜에 설명된 수동 블롯 앤 플런지 방법은 극저온 이미징을 위한 유리체 얼음 의 박막에서 생물학적 샘플을 신속하게 동결하는 비용 효율적이고 신뢰할 수 있으며 견고한 방법을 나타냅니다. 원고에 설명된 방법을 사용하여, 연구원은 수동 플런저를 조립및 작동시키고, 플래시 동결 생물학적 샘플에 적합한 극저온을 준비하고, 생물학적 표본을 포함하는 수동으로 얼룩 및 플런지 EM 그리드를 블롯 및 플런지 할 수 있습니다. 이 방법은 매우 견고하지만, 고해상도 이미징을 위한 최적의 얼음 두께와 품질을 얻기 위해 이 절차에서 중요한 단계에서 주의를 기울여야 합니다. 아래에서 이러한 몇 가지 중요한 단계를 설명하고 이러한 단계를 해결하는 방법에 대한 권장 사항을 제공합니다.
플런징 암은 플런지 후 황동 용기 내의 액체 에탄의 중앙에 그리드.......
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공개 사항
우리는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
Herzik 랩 회원들에게 이 원고와 비디오 콘텐츠에 대해 비판적으로 생각하고 피드백을 제공해 주신 것에 감사드립니다. M.A.H.주니어는 NIH R35 GM138206과 시얼 학자의 지원을 받고 있습니다. H.P.M.N은 분자 생물물리학 훈련 보조금(NIH T32 GM008326)에 의해 지원됩니다. 또한 스크립스 연구소의 빌 앤더슨, 찰스 보우먼, 가브리엘 랜더 박사에게 비디오에 표시된 수동 플런저를 설계, 조립 및 테스트하는 데 도움을 주신 것에 대해 감사드립니다.
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참고문헌
- Hofmann, S., et al. Conformation Space of a Heterodimeric ABC Exporter under Turnover Conditions. Nature. 571 (7766), 580-583 (2019).
- Fica, S. M., Nagai, K. Cryo-Electron Microscopy Snapshots of....
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