我们介绍了一种在不同发育阶段快速进行瞬时转导的技术 细粒棘球绦虫 使用第三代慢病毒载体。
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摘要
摘要
囊性包虫病，又称棘球蚴病，是由寄生于犬类肠道的小型绦虫Echinococcus granulosus引起的重要人畜共患寄生虫病之一。目前迫切需要开展应用性遗传学研究，以阐明其致病机制并实现疾病的控制与预防。然而，由于缺乏有效的基因评估系统，阻碍了对包括Echinococcus属在内的绦虫寄生虫功能遗传学的直接解读。本研究展示了慢病毒介导的瞬时转导技术在E. granulosus的中绦期和节片化虫体中的应用潜力。从棘球囊肿中分离原头节（PSCs），并转移至特定的双相培养基中，诱导发育为节片化成虫。将收获的第三代慢病毒颗粒用于感染这些虫体，同时以HEK293T细胞作为转导过程的对照。在感染后24小时和48小时，在节片化虫体中检测到明显的荧光信号，表明E. granulosus中实现了慢病毒介导的瞬时转导。本工作首次尝试在绦虫中应用基于慢病毒的瞬时转导技术，展示了具有前景的研究成果，有望为扁形动物生物学的实验研究提供新的技术路径。
引言
囊性包虫病（CE）是由绦虫引起的重要蠕虫病之一 细粒棘球绦虫， 带科内的小型绦虫1,2. 针对免疫诊断和疫苗开发的广泛研究 E. granulosus 已开展相关研究。然而，由于对寄生虫生物学的分子基础了解不足，给包虫病的诊断、治疗和预防带来了重大局限3,4,5,6.
近年来，随着基因组测序和转录组学方法的发展，多个研究团队已对扁形动物开展了广泛的分子生物学研究7,8,9。然而，在寄生虫领域，与某些原生动物已建立的高效且可重复的瞬时转导方法相比，寄生性扁形动物的基因转移技术进展仍然有限10,11,12。....
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方案
本研究已获得国家医学研究发展研究所和研究伦理审查委员会的批准，批准编号为958680。慢病毒被归类为生物安全二级（BSL-2）生物体；因此，本方案中的所有实验室培养操作均按照美国国立卫生研究院（NIH）指南，采用无菌实验室操作并在层流罩内进行。图1展示了针对不同阶段E. granulosus的研究方案示意图。
1. 收集包虫囊肿
- 从屠宰场常规屠宰的自然感染绵羊体内采集肝包虫囊肿。
- 在吸取原头蚴（PSCs）之前，使用无菌纱布和70%酒精彻底消毒囊肿表面。
- 将20–50 mL囊液抽出至无菌的50 mL锥形管中。
- 排空液体后，用锋利刀片切开囊壁，将生发层转移至无菌50 mL锥形管中，并短暂振荡（约2分钟），以提高原头蚴的收集率。随后将生发层转移至新的1.5 mL离心管中，用于分子鉴定。
- 用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗原头蚴3–5次。
- 将原头蚴置于0.1%伊红溶液中染色5分钟，于光学显微镜下观察以评估其活力。培养时应使用活力不低于95%的原头蚴。
- 用2 mL胃蛋白酶溶液（2 mg/mL，pH 2）处理原头蚴沉淀物15–20分钟。
- 为分离单个原头蚴，将原头蚴沉淀重悬于PBS中，并通过两层无菌纱布过滤至新的无菌50 m....
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结果
在此，我们介绍一种快速高效的瞬时转导技术 E. granulosus 通过使用第三代慢病毒载体。我们采用双相培养基培养PSCs以获得横裂体虫，方法如前所述25,26原头蚴在6周后发育为链状节片虫 体外不同发育阶段 E. granulosus 在双相培养基中观察到内陷的PSCs（图2A），外翻的PSCs（图2B），以及具有第一和第三节片体节形成的节片虫图2C-E）。分别从单相和双相培养物中获得的原头节和链节化蠕虫，用表达GFP的慢病毒进行转染（图3). 为避免自发荧光的干扰，将显微观察结果与所有三组样本的背景荧光进行比较，所有荧光信号高于背景水平的样本均被视为转染成功.......
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讨论
了解线虫和扁形动物生物学的分子基础对于理解人畜共患寄生虫的致病性至关重要27。缺乏有效的基因评估系统是直接解读绦虫寄生虫（包括Echinococcus属物种）功能遗传学的主要障碍12,27。本研究展示了慢病毒在E. granulosus中实现瞬时转导的优异潜力。
慢病毒转导结合了瞬时转导操作简便、速度快的特点，以及稳定细胞系表达水平高的优势，可用于将外源基因递送至哺乳动物细胞28。本研究的主要目标是阐明慢病毒载体转导的操作流程，该技术将在未来的包虫病研究中发挥关键作用。
本实验方案中需特别注意若干关键步骤。由于培养基中未添加抗生素，必须严格遵守无菌操作流程，否则在24小时后可能出现细菌和真菌污染。微生物污染会降低寄生虫的运动能力和存活率，且在72小时后，转染组和对照组的样本均将失效。
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本研究工作获得了伊朗德黑兰医学研究与发展国家研究所（NIMAD）精英研究人员资助委员会的资助，项目编号为958680。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 12孔培养板 | SPL Life Sciences | 30012 | |
| 25 cm2 培养瓶 | SPL Life Sciences | 70325 | |
| 6孔培养板 | SPL Life Sciences | 30006 | |
| 氯化钙 | Sigma-Aldrich | C4901-500G | 工作浓度：2.5 mM |
| CMRL 1066 培养基 | 赛默飞世尔科技 | 11530037 | |
| CO2 培养箱 | memmert | ICO150 | |
| D-(+)-葡萄糖 | Sigma-Aldrich | G8270-1KG | |
| DMEM | Life Technology | 12100046 | |
| 狗胆汁 | 从安乐死的犬只中分离，并通过0.2 μm滤膜除菌 μm 注射器滤器 | ||
| 伊红Y | Sigma-Aldrich | E4009-5G | 配制0.1%伊红用于工作排除试验 |
| 胎牛血清（FBS） | DNAbiotech | DB9723-100ml | 热灭活 的 FBS（40℃下30分钟） °C) |
| 胎牛血清（FCS） | DNAbiotech | DB9724-100ml | 热灭活 的 FCS（40 中 30 分钟） °C) |
| HEK293T细胞 | BONbiotech | BN_0012.1.14 | 人胚胎肾293T细胞 |
| HEPES 缓冲盐水 (HBS) | Sigma-Aldrich | 51558-50ML | 2x 浓缩液 |
| 倒置荧光显微镜 | OLYMPUS | IX51 | |
| 青霉素 | Sigma-Aldrich | P3032-10MU | 工作浓度：100 IU/mL |
| 胃蛋白酶 | 罗氏 | 10108057001 | 工作浓度：2 mg/mL，pH 2 |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | DNAbiotech | DB0011 | 该试剂在去离子水中不到1分钟内溶解。 |
| Polybrene（转染试剂） | Sigma-Aldrich | TR-1003-G | |
| RPMI 培养基 | BioIdea | BI-1006-05 | |
| 碳酸氢钠（NaHCO₃）3) | Sigma-Aldrich | S5761-1KG | |
| 链霉素 | Sigma-Aldrich | S9137-25G | 工作浓度：100 μg/mL |
| 第三代慢病毒质粒（pCDH513b） | SBI System Biosciences（BioCat GmbH） | CD513B-1-SBI | 转移载体（购自伊朗马什哈德伊朗学术研究与文化教育中心（ACECR）分子医学研究部） |
| 第三代慢病毒质粒（pLPI 和 pLPII） | Invitrogen（Life Technologies） | K4975-00 | 辅助载体（购自伊朗马什哈德市伊朗学术研究与文化教育中心（ACECR）分子医学研究部） |
| 第三代慢病毒质粒（pMD2G） | Addgene | 质粒 12259 | 辅助载体（购自伊朗马什哈德伊朗学术研究与文化教育中心（ACECR）分子医学研究部） |
| Tris/EDTA缓冲液（TE） | DNAbiotech | DB9713-100ml | |
| 胰蛋白酶 | Sigma-Aldrich | T9935-50MG | 1x 工作液（pH 7.4）–7.6) |
参考文献
- Deplazes, P., et al. Global distribution of alveolar and cystic echinococcosis. Advances in Parasitology. 95, 315(2017).
- Borhani, M., et al. Echinococcoses in Iran, Turkey, and Pakistan: Old diseases in the new millennium. ....
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