描述了两种相关方法，用于可视化突触传递所需的亚细胞事件。这些方案通过活细胞成像技术，实现对突触前钙离子内流和突触囊泡膜融合动态过程的实时监测。 体外 培养的神经元
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本文内容
摘要
摘要
在肌萎缩侧索硬化症（ALS）和/或额颞叶痴呆（FTLD）患者出现神经元变性之前，运动和认知功能障碍的原因是神经元之间以及运动神经元与肌肉之间的通讯功能障碍。突触传递的基本过程涉及膜去极化依赖性的突触小泡融合，并将神经递质释放到突触间隙中。该过程通过突触小泡所在部位的突触前末梢局部钙离子内流而实现。本文所述方案介绍了一种基于荧光的活体成像方法，可可靠地报告培养神经元中去极化介导的突触小泡胞吐作用及突触前末梢钙离子内流动态。
通过使用一种可掺入突触小泡膜的苯乙烯基染料，可以阐明突触小泡的释放过程。另一方面，为了研究钙离子内流，我们使用Gcamp6m，一种基因编码的荧光报告分子。我们采用高浓度氯化钾介导的去极化来模拟神经元活动。为了明确量化突触小泡的胞吐作用，我们测量归一化后的苯乙烯基染料荧光随时间的减少量。在相似的刺激条件下，钙离子内流会导致Gcamp6m的荧光增强。这种荧光变化的归一化与定量分析方法与苯乙烯基染料实验方案类似。这些方法可与基于转染的荧光标记突变蛋白过表达技术联合使用。这些实验方案已被广泛应用于研究FUS-ALS和C9ORF72-ALS模型中的突触功能障碍，所用细胞包括原代啮齿类动物皮层神经元和运动神经元。这些方案可便捷地用于快速筛选可能改善神经元通讯的化合物。因此，这些方法不仅对ALS研究具有重要价值，也适用于神经退行性疾病和发育神经科学领域的各项研究。
引言
在实验室中建立肌萎缩侧索硬化症（ALS）模型面临独特的挑战，主要原因在于超过80%的病例为散发性1，同时存在大量已知致病的基因突变2。尽管如此，所有ALS病例均具有一项共同特征：在神经元明显变性之前，突触前运动神经元与突触后肌细胞之间的通讯功能已出现障碍3,4。临床上，随着患者残余的上、下运动神经元连接性逐渐丧失，整个病程中可表现出神经元过度兴奋与兴奋性降低的特征5,6,7,8,9，这反映了这些突触背后复杂的分子变化，而我们作为ALS研究人员，正致力于揭示其机制。
多种转基因模型表明，随着ALS致病性基因突变（包括SOD1）的表达，神经肌肉接头会出现退化和结构紊乱10，FUS11,12
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方案
本研究中进行的所有动物实验均经杰斐逊大学机构动物护理和使用委员会批准。
1. 胚胎大鼠皮层神经元的原代培养
注意：原代皮层神经元取自 E17.5 大鼠胚胎，方法如先前文献所述57,58。该培养方案的成功率未见品系偏好性。下文将简要描述该方法，完整细节请参考前述相关文献。
- 通过吸入 CO2 处死怀孕的雌性大鼠，随后通过颈椎脱位进行二次确认。
- 在冰上预冷的 20 mM HEPES 缓冲的 Hank's 平衡盐溶液（HBSS）中收获胚胎并分离脑组织。从大脑皮层外层分离并弃去纹状体和海马，收集大脑皮层组织。
- 使用精细镊子去除大脑皮层上的脑膜。操作时，用一只手的闭合镊子轻轻夹住皮层组织固定位置。
注：用另一只手的镊子夹住脑膜，通过夹持镊子的滚动动作剥离脑膜。必要时重新调整闭合镊子的位置，重复操作直至完全去除脑膜。 - 将大脑皮层组织置于含 10 µg/mL 木瓜蛋白酶的 HBSS 溶液中，37 °C 孵育 4 分钟。
- 用 HBSS 洗涤三次，然后用火焰抛光的玻璃巴斯德移液管轻柔吹打 5–10 次，以获得均一的细胞悬液。
注：避免产生气泡；吹打时保持移液管....
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结果
在成功实施上述方案后，展示了一项典型的苯乙烯类染料突触小泡释放实验的代表性结果。培养的大鼠原代皮层神经元按照第6节所述方法加载染料。通过与突触小泡标志物突触素（synaptophysin）共标记来确定染料加载的特异性。大多数苯乙烯类染料阳性的斑点与此标志物共定位（图2A）。为确定苯乙烯类染料成像所用参数是否引起光漂白，通常对未处理的孔进行染料加载，并在无刺激条件下持续成像10分钟，以确保荧光值保持稳定。
此外，结果再次通过突触素（synaptophysin）与苯乙烯染料（styryl dye）的共标记来展示，如图2A所示。这些荧光团的共聚焦成像采用第6节中针对TRITC苯乙烯染料成像所描述的方案，并通过在DAPI通道使用高强度激光功率同时捕获突触素的荧光信号，以可视化mTurquoise-突触素。图中展示了刺激前后突触区域的代表性图像（图2B）。尽管该方法是对光漂白缺失的间接推断，但对整个成像期间原始强度.......
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讨论
两种所述方法中均包含三个关键步骤，对实验成功和获得可量化的结果至关重要。首先，每次实验前必须根据附带说明新鲜配制人工脑脊液（aCSF），这是必不可少的步骤。若未做到这一点，可能导致神经元无法正常去极化。在刺激任何实验组之前，应持续检测未经处理的对照组神经元，以确保细胞能够正常去极化，并为该次成像实验中获得的阳性结果提供基准参考。其次，为了成功追踪特定突触区域随时间变化的荧光信号，在设定成像参数及选择用于监测的感兴趣区域（ROI）时也需格外谨慎。基线记录阶段应无缝过渡至刺激记录阶段。必须采用足够高的帧率（每秒2帧），以准确捕捉styryl染料释放的单次衰减动力学过程。最后，实验分析中的一个关键步骤是将荧光强度测量值首先归一化至成像背景，再归一化至刺激前的基线水平。与其他成像方案类似，需首先从所有配对的时间-荧光测量值中减去空白成像区域的信号，以消除因加入KCl培养基可能引入的背景 自发荧光。此外，还必须测量并计算每个ROI在刺激前最后30秒基线期的平均荧光读数。该平均起始值将作为该ROI所有时间点测量的明确定义的起始点，用于量化"相对于基线的变化"强度。
原.......
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披露
作者声明不存在利益冲突。
致谢
我们感谢杰斐逊温伯格肌萎缩侧索硬化症中心的现任和前任成员，他们为优化这些技术及其分析方法提供了宝贵的反馈意见和建议。本研究得到了美国国立卫生研究院（NIH）（资助号：RF1-AG057882-01 和 R21-NS0103118，授予 D.T）、美国国家神经疾病与卒中研究所（NINDS）（资助号：R56-NS092572 和 R01-NS109150，授予 P.P）、肌肉萎缩症协会（D.T.）、罗伯特·帕卡德肌萎缩侧索硬化症研究中心（D.T.）、Family Strong 4 ALS 基金会以及法伯家族基金会（B.K.J.、K.K 和 P.P）的资助支持。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 20倍空气物镜 | Nikon | 用于成像 | |
| 40倍油浸物镜 | Nikon | 用于成像 | |
| B27添加剂 | Thermo Scientific | 17504044 | 神经元生长添加剂 |
| BD无针注射器，50 mL | Thermo Scientific | 13-689-8 | 重力灌流装置的组成部分 |
| 生物安全细胞培养罩 | Baker | SterilGARD III SG403A | 用于无菌细胞培养、转染和染料加载 |
| β-巯基乙醇 | Millipore Sigma | M3148 | 用于神经元培养的培养与维持 |
| 牛血清白蛋白 | Millipore Sigma | A9418 | 用于制备神经元培养物 |
| 二水合氯化钙 | Millipore Sigma | 223506 | aCSF溶液的组分 |
| 细胞培养CO2培养箱 | Thermo Scientific | 13-998-123 | 用于神经元的培养与维持 |
| 离心机 | Eppendorf | 5810R | 用于神经元培养物的制备 |
| 共聚焦显微镜 | Nikon | Eclipse Ti +A1R核心 | 用于荧光成像 |
| CoolSNAP ES2 CCD相机 | Photometrics | 用于图像采集 | |
| D-葡萄糖 | Millipore Sigma | G8270 | aCSF溶液的组分 |
| DNase | Millipore Sigma | D5025 | 用于神经元培养物的制备 |
| 雌性定时妊娠Sprague Dawley大鼠 | Charles river | 400SASSD | 用于制备胚胎皮层和脊髓运动神经元培养物 |
| FITC滤光立方体 | Nikon | 77032509 | 用于Gcamp钙瞬态成像 |
| FM4-64苯乙烯染料 | Invitrogen | T13320 | 用于突触囊泡释放成像 |
| 玻璃底培养皿（厚度#1.5） | CellVis | D35-10-1.5-N | 用于在适用于成像的培养皿上培养神经元 |
| 玻璃巴斯德吸管 | Grainger | 52NK56 | 用于制备神经元培养物 |
| 汉克平衡盐溶液（HBSS） | Millipore Sigma | H6648 | 用于制备神经元培养物 |
| HEPES | Millipore Sigma | H3375 | aCSF溶液的组分 |
| 高KCl人工脑脊液（aCSF） | 用于成像。请参见配方* | ||
| 马血清 | Millipore Sigma | H1138 | 用于神经元的培养与维持 |
| 层流通风解剖罩 | NUAIRE | NU-301-630 | 用于制备神经元培养物 |
| 层粘连蛋白 | Thermo Scientific | 23017015 | 用于制备神经元培养物 |
| Leibovitz's L-15培养基 | Thermo Scientific | 11415064 | 用于制备神经元培养物 |
| Leibovitz's L-15培养基，无酚红 | Thermo Scientific | 21083027 | 用于制备神经元培养物 |
| L-谷氨酰胺（200 mM） | Thermo Scientific | 25030149 | 神经元培养添加剂 |
| Lipofectamine 2000转染试剂 | Thermo Scientific | 11668019 | 用于神经元转染 |
| 低KCl人工脑脊液（aCSF） | 用于成像。请参见配方* | ||
| 氯化镁 | Millipore Sigma | 208337 | aCSF溶液的组分 |
| Microsoft Excel | Microsoft | 用于数据分析/归一化的软件 | |
| Nalgene 滤器单元，0.2 µm PES | Thermo Scientific | 565-0020 | aCSF溶液用滤器单元 |
| Neurobasal培养基 | Thermo Scientific | 21103049 | 用于神经元培养物的培养与维持 |
| NIS-Elements高级研究软件 | Nikon | 用于图像采集与分析的软件 | |
| Nunc 15 mL锥形管 | Thermo Scientific | 339650 | 用于制备神经元培养物和缓冲液 |
| Nunc 50 mL锥形管 | Thermo Scientific | 339652 | 用于制备神经元培养物和缓冲液 |
| Optiprep | Millipore Sigma | D1556 | 用于制备神经元培养物 |
| 木瓜蛋白酶 | Millipore Sigma | P4762 | 用于制备神经元培养物 |
| 青霉素-链霉素（10,000 U/mL） | Thermo Scientific | 15140122 | 用于防止神经元培养物的细菌污染 |
| 灌流系统 | Warner Instruments | SF-77B | 用于aCSF的更换 |
| 灌流管路 | Cole-Parmer | UX-30526-14 | 重力灌流装置的组成部分 |
| pGP-CMV-Gcamp6m质粒 | Addgene | 40754 | 用于钙瞬态成像 |
| 聚-D-赖氨酸氢溴酸盐 | Millipore Sigma | P7886 | 玻璃底培养皿的包被剂 |
| 氯化钾 | Millipore Sigma | P3911 | aCSF溶液的组分 |
| 碳酸氢钠 | Millipore Sigma | S5761 | aCSF溶液的组分 |
| 氯化钠 | Millipore Sigma | S9888 | aCSF溶液的组分 |
| 载物台培养箱 | Tokai Hit | 用于成像期间活神经元的孵育 | |
| TRITC滤光立方体 | Nikon | 77032809 | 用于FM4-64成像 |
| 胰蛋白酶抑制剂 | Millipore Sigma | T6414 | 用于制备神经元培养物 |
| 胰蛋白酶-EDTA（0.25%），含酚红 | Thermo Scientific | 25200056 | 用于制备神经元培养物 |
| 振动隔离台 | New Port | VIP320X2430-135520 | 显微镜用台/支架 |
参考文献
- Gibson, S. B., et al. The evolving genetic risk for sporadic ALS. Neurology. 89 (3), 226-233 (2017).
- Kim, G., Gautier, O., Tassoni-Tsuchida, E., Ma, X. R., Gitler, A. D. ALS genetics: Gains, losses, and implications for future therapies. Neuron. 108 (5), 822-842 (2020).
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